HILIC法优化分离效果
Venusil HILIC法测定皂苷1~7的色谱图。
本文采用亲水作用高效液相色谱法（HILIC）测定了七种川续断皂苷的含量，并对方法的精密度、最低检出限、重复性、稳定性进行了研究。本方法解决了以十八烷基硅胶键合为填充剂的色谱柱分离效果差的问题，方法准确，灵敏度高。
川续断是科川续断属植物川续断的根，具有补肝肾、强筋骨、续折伤、止崩漏、安胎等功效，《神农本草经》将其列为上品。用于胎漏、胎动不安、滑胎、腰膝酸软、跌打损伤、骨折等症。有效成分为川续断皂苷。近年，国内对川续断的研究日趋增多，已见有川续断皂苷的提取纯化、药理和临床方面的报道；但在质量控制方面由于川续断中七种皂苷极性较大，并且结果相似，在用高效液相色谱进行含量测定时，在普通C18进行反相色谱法常遇到分离效果不理想的现象。
本文采用亲水作用高效液相色谱法（HILIC），建立了HPLC法检测川续断中七种皂苷的含量，该方法能够较好地分离川续断中的七种皂苷，方法准确、简便、重现性好、峰型对称，可作为控制川续断质量的方法。
实验方法
色谱条件
色谱柱，Venusil HILIC丙基酰胺键合硅胶色谱柱，4.6×250mm，5μm （天津博纳艾杰尔科技有限公司）；流动相，乙腈：水=75:25；柱温，室温；流速，1.0ml/min；检测波长，210nm；进样量，10μl。
样品制备和测定
供试品溶液：量取川续断适量，将其粉碎成为100目得粉末，精密称取川续断粉末10g，置于100ml量瓶中，加甲醇5ml溶解，振摇10min，加水50ml振摇20min，加水稀释至刻度，摇匀，过滤，作为供试品溶液。
对照品溶液：精密称取川续断七种皂苷标准品细粉各10mg，置于100ml量瓶中，加甲醇50ml溶解，振摇10min，再加50ml甲醇至刻度，摇匀，过滤，作为标准品溶液。
精密量取10μl注入液相色谱仪，记录色谱图。
结果与讨论
由于有关药效性文献报道皂苷-5药效最为明显，本文将皂苷-5作为评价最低检出限、精密度、重复性、稳定性、加标回收率、线性范围的目标峰。
色谱柱的选择
分别选择用十八烷基硅胶键合为填充剂的色谱柱C18色谱柱A和C18色谱柱B，以及以丙基酰胺键合硅胶为填充剂的色谱柱 Venusil HILIC，在相同的色谱条件下，对同一样品进行色谱分析，以七种皂苷的分离度作为考察对象。实验结果显示，用十八烷基硅胶键合为填充剂的色谱柱第3、4组和6、7组糖苷无法分开，以丙基酰胺键合硅胶为填充剂的色谱柱Venusil HILIC，利用亲水作用色谱法能够将第3、4组和6、7组峰分开，峰型较好，因此选择采用亲水作用色谱法测定川续断七种皂苷的含量。
流动相的选择
实验中考察过乙腈含量对实验结果的影响，由于采用亲水正相色谱方式，随着乙腈浓度的增加分离度增加，保留时间增加，峰宽增加。实验表明，当乙腈：水=75:25时，峰型最为理想，分离度达到2.0以上。
最低检出限
取皂苷-5 12.5 mg，置25ml容量瓶中，加流动相不断稀释进样，记录峰面积，使峰高大约为基线噪音的3倍，记录色谱图。结果表明，在上述色谱条件下皂苷-5的检测限为5ng。
精密度
取川续断皂苷-5标准品10mg，20mg，50mg，精密称定，置50ml容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，定容。分别取此三种浓度的溶液各10μl，照上述色谱法各进样6份，测得三种浓度主峰峰面积RSD分别为（RSD=0.13%），（RSD=0.10%），（RSD=0.11%），平均RSD=0.11%。
重复性
取同一批川续断粉末样品5份，各5g。精密称定，置50ml烧瓶中，加甲醇超声溶解30min，过滤，将续滤液置于50ml量瓶中用甲醇定容至刻度。精密吸取10μl注入液相色谱仪，分别测定川续断皂苷-5的含量，结果表明，该方法的重复性较好。
稳定性
在不同时间段考察川续断甲醇提取液的稳定性，室温放置考察日间差异，过夜时密闭放置于4℃冰箱中，考察日间差异。
取川续断甲醇提取液10ml，精密吸取10μl注入液相色谱仪，分别测定不同时间川续断皂苷-5的含量。结果表明川续断样品溶液稳定。
加标回收率
采用加标回收方法验证方法的准确性，取批川续断粉末5g。精密称定，置50ml烧瓶中，加甲醇超声溶解30min，过滤，将续滤液置于50ml量瓶中用甲醇定容至刻度。准确续滤液5份，精密加入标准品适量，按照含量测定方法进样测定，并计算回收率。实验结果表明加标回收率良好，证明该方法测定川续断的含量可行。
线性范围
精密称取川续断皂苷-5标准品10mg，20mg，30mg，40mg，50mg，精密称定，置50ml容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，定容。分别取此五种浓度的溶液按照含量测定方法各进样10μl，测定。以标准品浓度为横坐标（X），以峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，进行线性回归。回归方程为：Y=541457X+20329，R2=0.9998。线性关系良好。
小结
本文针对川续断皂苷的化学性质，采用亲水正相色谱法（HILIC）建立了川续断中七种皂苷的检测方法。以皂苷-5作为评价标准，研究了方法的最低检出限、精密度、重复性、稳定性、加标回收率、线性范围。方法解决了常规C18分离方法分离效果差的现象，该方法可以作为川续断皂苷的质控方法。
