药物质量控制中微生物限度检验误差的重要性分析
目的：分析药品微生物限度检验误差的影响因素，为质量控制提供依据。
方法：对实验原料药A 、B 、C 、D 进行药品微生物限度检验。由5 名实验室工作人员，就微生物限度的误差影响因素进行分析，按照重要性进行评价。
结果：A 、B 、C 、D 四种药物细菌总数平水分别（72 ± 11 ）cfu／ml 、（60 ± 15 ）cfu／ml 、（54 ± 6 ）cfu／ml 、（56 ± 5 ）cfu／ml ，变异指数分别为0 .15 、0 .25 、0 .11 、0 .09 。5 名实验室工作人员评价显示，重要性评分从高到低分别为设计方法是否合理、检验次数／样本数、药物保存质量、药物性质、操作技术水平、被检验菌的性质、实验室环境。
结论：药品微生物限度检验误差不可避免存在误差，且不同药物的误差存在一定的差异；误差影响因素较多，需要特别重视合理的检验方法设计、确保足够的检验次数／样本数。
药品微生物限度检查是药物的质量评价的重要方法、关键环节，被广泛应用于成药、原料药的评价，是药物质量管理的重要方法。任何检验都不可避免存在误差，许多因素都会影响微生物的检验结果，如微生物自身的特性、原料药添加剂等。本文尝试将问卷调查、实验分析相结合，分析药品微生物限度检验误差的影响因素，为质量控制提供依据。
1 材料与方法
1 .1 仪器与试剂
EK 电子天平，生化培养箱，LRH － 150 － M 霉菌培养箱，电子恒温干燥箱，超净工作台，蒸汽灭菌前，均质器，菌落计数器，真空泵，细菌鉴定以及药敏测试仪等。培养基：胰酪大豆胨液体培养基（TSB） 、胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA） 、沙氏葡萄糖液体培养基等各种培养基。试剂包括十四烷酸异丙酯、氯化钠等。实验菌株，从中国食品药品检定研究院购买的冻干粉菌种，经过培养获得第3 代菌株，包括白色念珠菌、黑曲霉、金黄色葡萄球菌等。实验原料药A 、B 、C 、D。
1 .2 方法
1 .2 .1 实验部分
参照《中国药典2015 版》第四部中的方法，制得含量10 × 10＾3cfu／ml 金黄色葡萄球菌、酵母菌、白色念珠菌、黑曲霉菌悬液，备用。取得制备好的菌悬液，稀释成为100cfu／ml 菌悬液，采用薄膜过滤贴膜法进行定性。原料药按照性质选择合适溶制备方法。以水溶性原料药A 为例，以原料自身作为原液供试品，并用灭菌的pH7 .0无菌氯化钠— 蛋白胨缓冲液作为稀释液，依次制成1 ∶ 2 、1 ∶ 5 、1 ∶ 10 的供试液。参照《中国药典2015 版》给出的有关形态的药物微生物限度检查方法，进行固体、液体制剂需氧菌、霉菌、酵母菌的总数检查方法，依次分为平皿法、供试品溶液梯度稀释法，逐级回收，必要时进行薄膜过滤贴膜法等进行探索。计算不同稀释倍数菌回收比值：比值＝ （试验组菌落数－ 供试品对照组菌落数）／菌液对照组菌落数，结果显示比值应0 .5 ～ 2 .0 范围，否则需要进行方法的设计。
1 . 2 .2 讨论部分
由5 名实验室工作人员，就微生物限度的误差影响因素进行分析，按照重要性进行评价。影响非常大5 分、影响较大4 分、有一定的影响3 分、影响较小2 分、影响非常小1 分。
2 结果
B 、C 、D 四种药物细菌总数平分别（72 ± 11 ）cfu／ml 、（60 ± 15）cfu／ml 、（54 ± 6 ）cfu／ml 、（56 ± 5）cfu／ml ，变异指数分别为0 .15 、0 .25 、0 .11 、0 .09 。5 名实验室工作人员评价显示，重要性评分从高到低分别为设计方法是否合理、检验次数／样本数、药物保存质量、药物性质、操作技术水平、被检验菌的性质、实验室环境。见表1 。
3 讨论
从本次研究来看，四种原料药微生物的总数变异指数分别为0 .15 、0 .25 、0 .11 、0 .09 。相同的原料药、相同的检测法，检验结果都并不一致，提示微生物限度检验不可避免存在误差。从统计学的角度来看，检验水平围绕真实指标波动，平均数更接近真实的指标。每次检验的都可能产生误差，而误差的产生的原因比较复杂。
从小组讨论的结果来看，实验室人员普遍认为设计方法是否合理对误差影响较大。2015 年版《中国药典》有关于微生物限度检测方法要求检验菌要加到供试品溶液中，即菌液需要参与供试品的分散溶解过程，这能更真实的模拟细菌侵蚀药物的过程，避免实验室来源微生物的干扰 。但是这种方法明显提升了实验操作的难度，对原料的微生物限度检测方法设计要求更高。设计方法是否合理直接影响回收等参数，从而影响检验的误差。检验次数、样本数对误差的影响也较大，从统计学的角度来看，随着检验次数、样本数量的增长，可以减少偏差对均值的影响，避免偶然因素的干扰，使均值无限趋近于真实值。
除以上两个因素外，药物保存质量、药物性质、操作技术水平、被检验菌的性质、实验室环境等都影响检验限度误差。以药物性质为例，粉剂、液体原料药等不同性质的药物所需检验方法存在差异，同时原料本身中的抑菌成分、杂质等都会影响检验方法的信度，从而影响误差 。
因此在进行药品微生物限度检验时需要注意以下几点：
① 严格按照规范操作，根据被检微生物、药物性质等因素，科学的设计微生物限度的检验方法；
② 确保足够的检验样本数量，从而减少偏差，弥补检验方法技术缺陷；
③ 重视实验室的环境管理、药物保存管理，减少污染、样本质量等药械问题导致的误差；
④ 提高操作技术水平，避免违规操作。
小结：药品微生物限度检验误差不可避免存在误差，影响因素较多，需要加强质控。
