药物无菌和微生物限度检查技术
一、无菌检查法
无菌检查法系指检查《中国药典》要求无菌的药品医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。若供试品符合无菌检查法的规定,仅表明了供试品在该试验条件下未发现微生物污染。
除另有规定外,《中国药典》二部规定了注射剂用于烧伤或严重创伤的软膏剂与微乳膏剂;眼内注射溶液、眼内插入剂及供手术伤口、角膜穿通伤用的眼用制剂;植入剂;用于烧伤、创伤或溃疡的气雾剂;用于烧伤、创伤或溃疡的喷雾剂;用于烧伤、创伤的局部用散剂;用于手术、耳部伤口或耳膜穿孔的滴耳剂与洗耳剂;用于手术或创伤的鼻用制剂;冲洗剂;用于严重创伤的凝胶剂,均需进行无菌检查,并应符合规定。
无菌检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级单向流空气区域内或隔离系统中进行,其全过程必须严格遵守无菌操作,防止微生物污染,防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区与工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室(区)悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。隔离系统按相关的要求进行验证,其内部环境须符合无菌检查的要求。
二、微生物限度检查法
对于口服药及外用药,不必要求达到无菌状态,但要保证药物的卫生质量。这就要求进行微生物限度检查。微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查。控制菌检查指大肠埃希菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌及铜绿假单胞菌的检查。
微生物限度检查应在环境洁净度10000级下、局部洁净度100级的单向流空气区城内进行。检验全过程必须严格遵守无菌操作,防止再污染。单向流空气区域工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室(区)悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。
(一)检查前的准备工作
1.培养基的制备 微生物限度检查所用的培养基很多,如营养琼脂培养基、营养肉汤培养基、硫乙醇酸盐流体培养基、改良马丁培养基、改良马丁琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、酵母浸出粉葡萄糖琼脂培养基、胆盐乳糖培养基等,其配方和配制过程均需按《中国药典》规定的配方制备或者使用按该处方生产的符合规定的脱水培养基。配制后,应采用验证合格的灭菌程序灭菌。
2.菌液的制备
(1)菌种:验证试验所用的菌株传代次数不得超过5代(从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代),并采用适宜的菌种保藏技术,以保证试验菌株的生物学特性用作阳性对照的菌种有:大肠埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B)44102]金黄色葡萄球菌(SapHylococcus aureus)[CMCC (B)26003]、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis )[CMCC(B)63501]、白念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F)98001]、黑曲霉(Aspergillus nige)[CMCC(F)98003]、乙型副伤寒沙门菌(Salmonella paratyphiB)[CMCC(B)50094]生孢梭菌(Clastridium sporogenes)[CMCC (B)64941]、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)[CMCC(B)10104]。
(2)菌液制备:接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基中;生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中,培养18~24时;接种白念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基中,培养24~48小时。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50-100CFU的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中,培养5～7天,加入3~5ml含0.05%(V/V)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱。然后,吸出孢子悬液(用管口带有薄的无菌棉花或纱布、能过滤菌丝的无菌毛细吸管)至无菌试管内,用含0.05%(V/V)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50-100CFU的孢子悬液。
3、稀释液的制备
(1)pH7.0无菌氯化钠-蛋白陈缓冲液:取磷酸二氢3.56g、磷酸氢二钠7.23g、氯化钠4.30g、蛋白胨1.0g、加水1000ml,微温溶解,滤清,分装,灭菌。
(2)pH6.8无菌磷酸盐缓冲液、pH7.6无菌磷酸盐缓冲液:按《中国药典》附录配制。
如需要,可在上述稀释液灭菌前或灭菌后加入表面活性剂或中和剂等。
(3)09%无菌氯化钠溶液:取氯化钠9.0g,加水溶解使成1000ml,过滤,分装,灭菌然后过滤,分装,灭菌。
稀释液配制后,应采用验证合格的灭菌程序灭菌。
(二)方法验证试验
当建立药品的微生物限度检查法时,应进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法和控制菌检查方法的验证,以确认所采用的方法适于该药品的细菌霉菌及酵母菌数的测定和控制菌的检查。若药品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时,计数方法应重新验证。供试品检查时,如果使用了表面活性剂、中和剂或灭活剂,应证明其有效性验证及对微生物的生长和存活无影响。
验证时,规定按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母菌计数及控制菌检查法所规定的方法及要求进行。对各试验菌的回收率应逐一进行验证。依各品种项下微生物限度标准中检查的控制菌选择相应验证的菌株,验证大肠菌群检查法时,应采用大肠埃希菌作为验证菌株。
验证试验至少应进行3次独立的平行试验,并分别计算各试验菌每次试验的回收率。验证试验也可与供试品的细菌、霉菌及酵母菌计数和控制菌检查同时进行。
1.细菌、霉菌及酵母计数方法的验证
(1)试验组:平皿法计数时,取试验可能用的最低稀释级供试液1ml和50-100CFU试验菌,分别注入平皿中,立即倾注琼脂培养基,每株试验菌平行制备2个平皿,按平皿法测定其菌数。薄膜过滤法计数时,取规定量试验可能用的最低稀释级供试液,过滤冲洗,在最后一次的冲洗液中加入50-100CFU试验菌,过滤,按薄膜过滤法测定其菌数。
(2)菌液组:测定所加的试验菌数。
(3)供试品对照组:取规定量供试液,按菌落计数方法测定供试品本底菌数。
(4)稀释剂对照组:若供试液制备需要分散、乳化中和、离心或薄膜过滤等特殊处理时,应增加稀释剂对照组,以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。试验时,可用相应的稀释液替代供试品,加入试验菌,使最终菌浓度为每1ml供试液含50-100CFU,按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。
(5)结果判定:在3次独立的平行试验中,稀释剂对照组的菌回收率(稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率)应均不低于70%。
若试验组的菌回收率(试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的百分率)均不低于70%,照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数;若任一次试验中试验组的菌回收率低于70%,应采用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性,并重新进行方法验证。
2.控制菌检查方法的验证
(1)试验组:取规定量供试液及10-100CFU试验菌加增菌基中应控制菌检查法进行检查。当采用薄膜过滤法时,取规定量供试液,过滤,冲洗,试验菌应加在最后一次冲洗液中,过滤后,注入增菌培养基或取出滤膜接入增菌培养基中。
(2)阴性菌对照组:设立阴性菌对照组是为了验证该控制菌检查方法的专属性。方法同试验组,验证大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌检查法时的阴性对照菌采用金黄色葡萄球菌;验证铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌,梭菌检查法时的阴性对照菌采用大肠埃希菌。阴性对照菌不得检出。
(3)结果判定:阴性菌对照组不得检出阴性对照菌。若试验组检出试验菌,按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查;若试验组未检出试验菌,应采用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性,并重新进行方法验证。
(三)供试品的检查
1.检验量检验量即一次试验所用的供试品(g、ml或cm2)。除另有规定外,一般供试品的检验量为10g或10ml:化学膜剂为100cm2;贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。要求检查沙门菌的供试品,其检验应增加20g或20ml(其中10g用于阳性对照试验)检验时,应从2个以上最小包装单位中抽取供试品,膜剂还不得少于4片。一般应随机抽取不少于检验用量(两个以上最小包装单位)的3倍量供试品。
2.供试液的制备根据供试品的理化特性与生物学特性,可采取适宜的方法制备供试液。供试液制备若需用水浴加温时,温度不应超过45℃。供试液从制备至加入检验用培养基,不得超过1小时。
除另有规定外,常用的供试液制备方法如下。
(1)液体供试品:取供试品10ml,加pH7.0无菌氯化钠-蛋白缓冲液至100ml,混匀,作为1:10的供试液。油剂可加入适量的无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀。水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。
(2)固体、半固体或黏稠液供试品:取供试品10g,加pH7.0无菌氯化钠-蛋白缓冲液至100ml,混匀,作为1:10的供试液。必要时加适量的无菌聚山梨酯80,并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。
3.检查方法
(1)细菌、霉菌及酵母菌检查:检查方法包括平皿法和薄膜过滤法。检查时,按已验证的计数方法进行供试品的细菌、霉菌及酵母菌菌数的测定。取按验证的方法制备的均匀供试液,用pH70无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释成1:10、1:100、1:1000等稀释级。
1)平皿法:采用平皿法进行菌数测定时,应取适宜的连续2～3个稀释级的供试液。取供试液1ml,置直径90mm的无菌平皿中注入15～20ml温度不超过45℃的溶化的营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基,混匀,凝固,倒置培养。每稀释级每种培养基至少制备2个平板。
阴性对照试验 取试验用的稀释液1ml,置无菌平皿中,注入培养基,凝固,倒置培养。每种计数的培养基各制备2个平板,均不得有菌生长。
培养和计数 除另有规定外,细菌培养3天,逐日点计菌落数,一般以3天的菌落数报告;霉菌、酵母菌培养5天,逐日点计函落数,一般以5天的菌落数报告;必要时,可适当延长培养时间至7天进行菌落计数并报告。菌落蔓延生长成片的平板不宜计数点计菌落数后,计算各稀释级供试液的平均菌落数,按菌数报告规则报告菌数。若同释级两个平板的菌落平均数不小于15,则两个平板的菌落数不能相差1倍或以上。
一般营养琼脂培养基用于细菌计数;玫瑰红钠琼脂培养基用于霉菌及酵母菌计数酵母浸出粉葡萄糖琼脂培养基用于酵母菌计数。在特殊情况下,若营养琼脂培养基上长有霉菌和酵母菌、玫瑰红钠琼脂培养基上长有细菌,则应分别点计霉菌和酵母菌细菌菌落数。然后将营养琼脂培养基上的霉菌和酵母菌数或玫瑰红钠琼脂培养基上的细菌数,与玫瑰红钠琼脂培养基中的霉菌和酵母菌数或营养琼脂培养基中的细菌数进行比较,以菌落数较高的培养基中的菌数为计数结果。
含蜂蜜、王浆的液体制剂,用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌数,用酵母浸出粉胨葡菌数报告规则宜选取细菌、酵母菌平均菌落数小于300CFU、霉菌宜选择平均菌萄糖琼脂培养基测定酵母菌数,合并计数。
落数小于100CFU的稀释级,作为菌数报告(取两位有效数字)的依据。以最高的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告1g、1ml或10cm²供试品中所含的菌数。如各稀释级的平板均无菌落生长,或仅最低稀释级的平板有菌落生长,但平均菌落数小于1时,以<1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。
2)薄膜过滤法:采用薄膜过滤法,滤膜孔径不大于0.45μm,直径约为50mm。选择滤膜材质时应保证供试品及其溶剂不影响微生物的充分被截留。滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌。使用时,应保证滤膜在过滤前后的完整性水溶性供试液过滤前先用少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品,其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥。为发挥滤膜的最大过滤效率,应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试液经薄膜过滤后,若需要用冲洗液冲洗滤膜,每张滤膜每次冲洗量不超过100ml,总冲洗量不得超过1000ml,以避免滤膜上的微生物受损伤。
取相当于每张滤膜含1g或1ml供试品的供试液,加至适量的稀释剂中,混匀,过滤。若供试品每1g或1ml所含的菌数较多时,可取适宜稀释级的供试液1ml进行试验。用pH7.0无菌氯化钠-蛋白缓冲液或其他适宜的冲洗液冲洗滤膜,冲洗方法和冲洗量同“计数方法的验证”。冲洗后取出滤膜,菌面朝上贴于营养琼脂培养基或玫瑰红钠培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基平板上培养。每种培养基至少制备一张滤膜。
阴性对照试验 取试验用的稀释液1ml,照上述薄膜过滤法操作,作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。
培养和计数 培养条件和计数方法同平皿法,每片滤膜上的菌落数应不超过100个。菌数报告规则以相当于1g或1ml供试品的菌落数报告菌数;若滤膜上无菌生长,以<1报告菌数(每张滤膜过滤1g、1ml或10cm²供试品)或<1乘以稀释倍数的值报告菌数。
(2)控制菌检查:供试品的控制菌检查应按已验证的方法进行,增菌培养基的实际用量同控制菌检查方法的验证。
阳性对照试验 进行供试品控制菌检查时,应阳性对照试验。阳性对照试验的加菌量为10-100CFU。阳性对照试验应检出相应的控制菌。
阴性对照试验 取稀释液10ml照相应控制菌检查法检查,作为阴性对照。阴性对照应无菌生长。
1)大肠埃希菌(Escherichia coli):取供试液10ml(相当于供试品1g、1ml、10cm²),直接或处理后接种至适量(不少于100ml)的胆盐乳糖培养基中,培养18-24小时,必要时可延长至48小时。取上述培养物0.2ml,接种至含 5ml MUG培养基的试管内,培养,于5小时、24小时在366nm紫外线下观察,同时用未接种的MUG培养基作本底对照。若管内培养物呈现荧光,为MUG阳性;不呈现荧光,为MUG阴性。观察后,沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液,液面呈玫瑰红色,为靛基质阳性;呈试剂本色,为靛基质阴性。本底对照应为MUG阴性和靛基质阴性。
如MUG阳性、靛基质阳性,判供试品检出大肠埃希菌;如MUG阴性,靛基质阴性判供试品未检出大肠埃希菌;如MUG阳性、靛基质阴性,或MUG阴性、靛基质阳性,均应取胆盐乳糖培养基的培养物划线于曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基的平板上,培养18～24小时。
若平板上无菌落生长、或生长的菌落与表1所列的菌落形态特征不符,判供试品未检出大肠埃希菌。若平板上生长的菌落与表1所列的菌落形态特征相符或疑似,应进行分离、纯化、染色镜检和适宜的生化试验,确认是否为大肠埃希菌。
表1
培养基 | 菌落形态 |
曙红亚甲蓝琼脂 | 呈紫黑色、浅紫色、蓝紫色或粉红色、菌落中心呈深紫色或无明显暗色中心、圆形,稍凸起,边缘整齐,表面光滑,湿润,常有金属光泽 |
麦康凯琼脂 | 鲜桃红色或微红色,菌落中心呈深桃红色,圆形,扁平,边缘整齐,表面光滑,湿润 |
2)大肠菌群(Coliform):取含适量(不少于10ml)的胆盐乳糖发酵培养基管3支,分别加入1:10的供试液1ml(含供试品0.1g或0.1ml),1:100的供试液1ml(含供试品0.01g或0.01ml),1:1000试液1ml(含供试品0.001g或0.01ml)另取1支胆盐2酵培养基加入稀释液1ml作为阴性对照管。培养18～24小时。
胆盐乳糖发酵管若无菌生长、或有菌生长但不产酸产气,判该管未检出大肠菌群若产酸产气,应将发酵管中的培养物分别划线接种于曙红亚甲蓝培养基或麦康凯琼脂培养基的平板上,培养18-24小时。
若平板上无菌落生长,或生长的菌落与表2所列的菌落形态特征不符或为非培养兰阴性无芽孢杆菌,判该管未检出大肠菌群;若平板上生长的菌落与表2所列的菌落形态特征相符或疑似,且为革兰阴性无芽孢杆菌,应进行确证试验。
表2
培养基 | 菌落形态 |
曙红亚甲蓝琼脂 | 呈紫黑色、紫红色、红色或粉红色,圆形,扁平或稍凸起,边缘整齐,表面光滑,湿润 |
麦康凯琼脂 | 鲜桃红色或粉红色,圆形,扁平或稍凸起,边缘整齐,表面光滑,湿润 |
确证试验 从上述分离平板上挑选4-5个疑似菌落,分别接种于乳糖发酵管中,培养24-48小时。若产酸产气,判该胆盐乳糖发酵管检出大肠菌群,否则判未检出大肠菌群。根据大肠菌群的检出管数,按表3报告1g或1ml供试品中的大肠菌群数。
表3
各供试品量的检出结果 | 可能的大肠菌群数群数N(个/克或个/毫升) | ||
0.1g或0.1ml | 0.01g或0.01ml | 0.001g或0.001ml | |
+ | + | + | |
+ | + | - | |
+ | - | ||
- | - | <10 |
注:“+”代表检出大肠菌群;“-”代表未检出大肠菌群
3)沙门菌(Salmonella):取供试品10g或10ml,直接或处理后接种至适量(不少于200ml)的营养肉汤培养基中,用匀浆仪或其他适宜方法混匀,培养18～24小时。
取上述培养物1ml,接种于10ml四硫磺酸钠亮绿培养基中,培养18～24小时后,分别划线接种于胆盐硫乳琼脂(或沙门、志贺菌属琼脂培养基和麦康凯琼脂(或曙红亚甲蓝琼脂)培养基的平板上,培养18～24小时(必要时延长至40~48小时)。若平板上无菌生长,或生长的菌落不同于表4所列的特征,判供试品未检出沙门菌。
表4
培养基 | 菌落形态 |
胆盐硫乳琼脂 | 无色至浅橙色,半透明,菌落中心带黑色或全部黑色或无黑色 |
沙门志贺菌属琼脂 | 无色至淡红色,半透明或不透明,菌落中心有时带黑褐色 |
曙红亚甲蓝琼脂 | 无色至浅橙色,透明或半透明,光滑湿润的圆形菌落 |
麦康凯琼脂 | 无色至浅橙色,透明或半透明,菌落中心有时为暗色 |
若平板上生长的菌落与表4所列的菌落形态特征相符或疑似,用接种针挑选2～3个菌落分别于三糖铁琼脂培养基高层斜面上进行斜面和高层穿刺接种,培养18-24小时,如斜面未见红色、底层未见黄色;或斜面黄色、底层无黑色,判供试品未检出沙门菌。否则,应取三糖铁琼脂培养基斜面的培养物进行适宜的生化试验和血清凝集试验,确认是否为沙门菌。
(四)结果判定
1.供试品检出控制菌或其他致病菌时,按一次检出结果为准,不再复试。
2.供试品的细菌数、霉菌和酵母菌数其中任何一项不符合该品种项下的规定,应从同一批样品中随机抽样,独立复试两次,以3次结果的平均值报告菌数。
3.眼用制剂检出霉菌和酵母菌数时,必须以两次复试结果均不得长菌,方可判供试品的霉菌和酵母菌数符合该品种项下的规定。
4.若供试品的细菌数、霉菌和酵母菌数及控制菌3项检验结果均符合该品种项下的规定,判供试品符合规定;若其中任何一项不符合该品种项下的规定,判供试品不符合规定。
(五)注意事项
1.药品在检验前,应保持原包装状态,不得开启,以免污染。同时药物需放置于阴凉干燥处,防止微生物繁殖,以免影响检验结果。凡原包装已被启开者,应另行取样。
2.供试品检验全过程必须符合无菌技术要求。使用灭菌用具时,不能接触可能污染的任何器物,灭菌吸管不得用口吹吸。
3.操作间温度应控制在18～26℃,相对湿度40%～60%。
4.培养基的分装量不得超过容器的2/3,以免灭菌时溢出。包装时,塞子必须塞紧塞入2/3,以免松动或脱落造成染菌。
5.培养基配制后应在2小时内灭菌,避免细菌繁殖;已熔化的培养基应一次用完,开启后不宜再用;且勿用电炉直接熔化琼脂培养基,应用水浴或微波炉加热;从供试品稀释至倾注琼脂培养基应在1小时内完成。
