造血细胞集落形成实验

2020.8.17

实验方法原理用琼脂或甲基纤维素混悬骨髓细胞，然后将细胞接种于培养皿，加入合适的生长因子。

实验材料骨髓细胞甲基纤维素Noble琼脂FBS生长因子10%BSAWehi-CM

仪器、耗材 Alpha培养基Petri培养皿水浴箱培养箱

实验步骤

甲基纤维素液的配制：

(a)称 7.2 g 甲基纤维素，放入盛有 1 个较大磁棒的 500 ml 瓶；

(b)将甲基纤维素高压灭菌；

(c)加入 400 ml 加热至 90°C 的无菌超纯水，将甲基纤维素弄湿；

(d)在 4°C 条件下，搅拌过夜，使甲基纤维素溶解，得到 2× 甲基纤维素。用不带针头的注射器分装甲基纤维素比吸管更精确。

Alpha 培养液的储存液配制：

(a)粉末状 Alpha 培养基（GIBCO，10 L 包装量）；

(b)100 ml 100×MEM 维生素储存液；

在加热的搅拌器上搅拌培养液，直至培养基溶解。温度不要超过37°C 。然后，加入超纯水，制成3 L 。在用孔径为 0.22 μm 的滤器进行最终过滤之前，最好先后用孔径为 5 μm 、1.2 μm、0.8 μm 和 0.45 μm 的滤器过滤。分装成 21 ml，在 -20°C 条件下储藏。

2×Alpha 培养液的配制：

(a)21 ml Alpha 培养液的储存液；

(b)25 ml 胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）；

(d)3 ml 7.5% 碳酸氢钠。

将上述成分放入无菌瓶，混合，平衡至 37°C。

一、BFU-E、CFC-mix 和 CFU-GEMM 的培养

1. 将添加 BSA 的 2×Alpha 培养液和等量的 2×甲基纤维素混合，制成实验需要的培养液。将混合液保持在冷的状态。当处于冷状态时，甲基纤维索较稀薄。

2. 准备细胞一式三份，但需准备用于 4 个培养皿那么多的混合培养液。由于甲基纤维素粘于试管壁上，常会丢失一些。

3. 将需要浓度的生长因子加入试管内。

4. 加入 5×104 个细胞。

5. 加入 1×培养液，使总量至 4.4 ml。将试管放在旋涡混合器上，混合。

6. 用注射器将 1 ml 细胞悬液注入 3 cm 非培养级培养皿。

7. 在 37°C 以及 10% CO2 和 5 % O2 的湿润气体条件下，将细胞培养 8~15 d。

克隆鉴定

BFU-E 集落可以是由很小的细胞构成的单一集落，也可以是多中心集落（像炸弹爆炸），每个集落有紧密排列的很小的淡红色细胞或红色细胞。这些集落的发生率为 40~80 个/105 个骨髓细胞。

CFC-mix 集落是单一而密集的集落，通常有细胞光环，细胞体积差别较大。集落可以是多中心的，但细胞显然是多源性的。CFC-mix 集落发生率为 100~180 个/105 个骨髓细胞，其中约 10 % 集落为含有红细胞系细胞的混合性集落。如果红细胞系细胞不是红色，对于无经验者来说很难准确鉴定这些集落。应当对集落进行摄影后取出细胞，然后离心，以便固定细胞和用 10% Giemsa 染色。通过鉴定细胞，帮助确认集落。

二、GM-CFC 的培养

1. 使用 30 mm Petri 培养皿（非培养级）。准备培养皿，并进行标记。

2. 配制 0.3 % 琼脂培养液，在 37°C 条件下放置。

3. 准备骨髓细胞（见方案 23. 22）。用美蓝染色后计数有核细胞，或者用 Zapo-globin （Beckman Coulter）溶解细胞后再用电子细胞计数仪计数细胞核。

从每块股骨获得 1.0×107~1.5×107 个细胞。

4. 向每个培养皿加入 0.1 ng/ml rMurGM-CSF。

5. 加入 1 ml 含有 7.5×104 个细胞的琼脂培养液。然后，轻轻摇足，使细胞和琼脂混合。在室温条件下，让琼脂下沉。

6. 另外，可用 0.8 % 甲基纤维素培养液。用甲基纤维素培养液培养时，一般产生较紧密的集落。这种集落易于计数。

7. 将培养皿放入 1 个清洁的塑料盒内。

8. 将塑料盒放入湿润的培养箱内，在 37°C 和 5 % O2 的条件下培养 6 d。

9. 用倒置显微镜计数含有 50 个细胞的集落，以 105 个种植细胞中的集落数表示。

10. 正常骨髓 GM-CFC 的发生率为 100~120 个/105 个骨髄细胞。