体外细胞的原代培养、传代培养、冻存和复苏-2
（4）复苏：
1.取出冷冻管，立即放入37℃水浴箱中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化，移入无菌操作台内。
2.打开冻存管，将细胞悬液吸到离心管中。
3.1000rpm离心10分钟，弃去上清液。
4.加适当培养液后将细胞转移至培养瓶中，37℃培养，第二天观察生长情况。
三、实验结果计算
1.一只小鼠可获得（1～2.5）×108个脾细胞。
2.细胞接种后一般几小时内就能贴壁，并开始生长，如接种的细胞密度适宜，5天到一周即可形成单层。
3.一般情况，传代后的细胞在2小时左右就能附着在培养瓶壁上，2～4天就可在瓶内形成单层，需要再次进行传代。
四、注意事项
1.取材要求新鲜，无菌，解剖小鼠时，注意不要损伤脾脏及其周围的脏器，尤其是肠道等，防止污染脾脏。
2.冲洗脾脏时要尽量洗净血污，去除无用组织，并要防止组织干燥。
3.碾磨后及时用清水冲洗筛网，防止组织、细胞阻塞网孔。
4.计数前，注意吸尽平皿里的细胞，充分混匀，使细胞分散成单个细胞。
5.实验操作应在操作台中央无菌区域内进行，勿在边缘非无菌区域操作。
6.金属器械不能在火焰中烧的时间过长，烧过的金属镊要待冷却后才能挟取组织，以免造成组织损伤。
7.另外胶塞过火焰时也不能时间长，以免烧焦产生有毒气体，危害培养细胞。
8.吸取过营养液后的吸管不能再用火焰烧灼，因残留在吸管头中营养液能烧焦形成炭膜，再用时会把有害物带入营养液中。
9.不能用手触及已消毒器皿瓶口、瓶塞内部，吸管前部等所有可能与细胞接触的部分，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。
10.开启、关闭长有细胞的培养瓶时，火焰灭菌时间要短。防止因温度过高烧死细胞。
11.换液时倾倒废液，瓶口不能接触废液缸，速度不能过快，防止废液四溅。
12.吹打细胞时，要注意边角的细胞是否吹打下来。
13.手或相对较脏的物品不能经过开放的瓶口上，即不可以在开放容器上方操作。
14.每次操作只处理一株细胞，以免造成细胞交叉污染。
15.注意自身的安全，对于来自人源性或病毒感染的细胞株应特别小心。操作过程中，应避免引起气溶胶的产生，小心有毒性试剂例如DMSO，并避免尖锐物品伤人等。
16.从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生长期细胞。在冻存前一天最好换一次培养液。
17.将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤。
