小鼠脾脏T细胞和人PBMCs的体外T细胞活化实验（一）
导言
成熟T细胞通过TCR识别并与抗原-MHC复合物反应。TCR活化的最直接后果是信号通路的起始，这些信号通路包括诱导特异性蛋白酪氨酸激酶（PTKs）、PIP2分解、PKC活化以及细胞内钙离子浓度的升高。这些早期事件被传递到核，产生诸多效应：
1、 T细胞克隆的扩增
2、 细胞表面活化标志的上调
3、 分化成效应性细胞
4、 诱导细胞毒或细胞因子的分泌
5、 诱导凋亡
最常用的体外刺激检测 T细胞增殖的方法是用 TCR的抗原或竞争性抗体活化 T细胞。
本 protocol 是一个基本方法，用 CD3 体外刺激小鼠脾 T 细胞和人类外周血 T细胞的增殖，关键参数包括细胞密度、抗体滴度和活化动力学。
一、 小鼠：
用包被的 145-2C11单抗刺激小鼠T细胞；MTT法测细胞增殖
材料
1X 无菌 PBS
Anti-mouse CD3e, Clone 145-2C11 (Functional Grade, eBioscience Cat. No. 16-0031, or Purified,eBioscience Cat. No. 14-0031)
RPMI-1640 完全培养基
无菌的小鼠脾脏或淋巴结单细胞悬液
96 孔平底带盖微孔板
MTT Buffer
MTT裂解液
刀豆蛋白 A，可选 (ConA, Sigma Cat. No. C5275)
仪器用具
微量移液器或排枪
离心机
37°C, CO2培养箱
96孔板读板机
实验时间
2小时包被抗体
20分钟制备脾脏单细胞悬液
20分钟分析设置
2-4天孵育
实验步骤
抗体包被至微孔板：
1、 用无菌 PBS 制备 5-10µg/ml 的 anti-CD3e (145-2C11)抗体溶液，计算所需的抗体量，每个条件或样品做复孔。例如，包被半张板需要 2.6ml 抗体溶液。若用其他抗体共刺激时，CD3 抗体的浓度可以降低。
2、 每孔加入 50μl 抗体，空白对照孔加 50μl 无菌 PBS。
3、 用ParafilmTM膜将板封好，37℃孵育 2 小时或 4℃过夜。
4、 加细胞之前，将孔内的抗体溶液吸去。
5、 每孔用 200μl 无菌 PBS 洗后，弃去 PBS。
6、 重复洗一次，去除所有的未结合抗体。
加细胞：
1、 取脾脏，无菌制备单细胞悬液。溶血去除红细胞。
2、 计数细胞并重悬于RPMI-1640 完全培养基中，浓度为 106/ml。根据实验需要可选择 2-3x106/ml～105/ml的浓度。
3、 洗板结束后，每孔加 200μl 细胞悬液，置于潮湿的 37°C, 5% CO2 培养箱中。可选择加刺激对照：ConA 1-4µg/ml 刺激后孵育。
4、 孵育 2-4 天。可根据具体的实验进行优化。
5、 每孔加 20μl MTT buffer 再放回至培养箱中孵育 4 小时。
6、 每孔加 50μl MTT 裂解液，轻轻振荡并孵育过夜。
7、 第二天 570nm 读板。
8、 计算平均值和标准方差，作图。
二、 人：
用 CD3 单抗刺激人外周血单个核细胞（PBMCs）；MTT 法检测细胞增殖。
