肿瘤细胞的荧光免疫表型和 FISH 共分析实验
染色体畸变通常在大多数血液肿瘤和各种实体瘤中检测到,在临床病理上,经常与判定肿瘤的直接形态和免疫表型特征有关。染色体畸变的检测为逐条诊断和肿瘤遗传分类奠定了基础。尤其在白血病和淋巴瘤中,许多主要的染色体畸变与疾病的临床分期有关。另外,在肿瘤预后过程中,还将发生其他染色体的畸变。因此,细胞遗传学结果对预后估计和选择治疗方案有很大帮助。
实验材料 | 正常鼠血清鼠单克隆抗地髙辛抗体鼠抗 FITC 抗体AMCA-亲和素FITC-亲和素生物素化山羊抗亲和素抗体Cy3 标记的亲和素Cy3 标记的山羊抗鼠抗体Cy3 标记的兔抗山羊抗体Cy3 标记的驴抗兔抗体Cy3 标记的兔抗鼠抗体地高辛标记的山羊抗鼠抗FITC 标记的驴抗鼠抗体FITC 标记的山羊抗地高辛抗体缓冲液SSC |
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试剂、试剂盒 | 单克隆鼠抗人抗体人 Cot-1 DNA人胎盘 DNA硫酸葡聚糖Sephadex 050 分离柱超声破碎的鲑鱼精子DNA70% 、85% 和 100% 乙醇橡皮泥去离子甲酰胺DAPI (46-二氨基-2-苯基吲哚)DABCO (222-三乙烯-14-二胺) |
实验步骤 | 一、标本制备同时进行免疫表型和 FISH,可以使用细胞离心制片、涂片、印迹或冰冻切片。适当的操作和保护细胞完整是成功完成这部分实验的关键。一般来说,新鲜制备的标本片应该晾干过夜 再转入-20°C 或一 80°C 保存。低温下标本片可以保存数周甚至数年。自冰箱取出后,标本片应在室温下解冻,并晾干后再使用。使用前,应该在相差显微镜下检查细胞的形态和位置。下面 是细胞离心制片的制作方法。 1.将机体组织如淋巴结或实体瘤组织在 PBS 缓冲液中用剪或刀切成小块。 2.收集得到细胞悬液。 3.200 g 离心 IOmin。 4.弃去上清,PBS 重悬细胞。 5.细胞计数。 6.调节细胞浓度至 IXlO4 个/mL。 7.取 200, 细胞悬液加入细胞离心机,200 g(800r/min) 离心 5 min。 8.晾干标本片过夜或室温下放置至少 2 h。 9.-20℃ 保存标本片。 二、免疫表型根据需要解决的问题,进行一两次免疫表型实验。下面是两种实验方法。 单抗原的免疫表型
16.70%、85% 和 100% 梯度乙醇脱水,每次 3 min,晾干至少 lOmin,预备进行 FISH 实验(见上述的 3.3)。 双重免疫表型(如 CD4 和 CD8)第一抗原的免疫表型第二抗原的免疫表型三、FISHDNA 探针制备多拷贝探针许多多拷贝探针已经商品化,如 Vysis。一般实验使用杂交 mastermixI,但是如果是商品探针,建议按照生产商的说明书进行实验。 单拷贝或特异位点 DNA 探针这些探针克隆在不同的载体(从噬菌体到 BAC、PAC、YAC) 上。DNA 用生物素、地高辛或突光染料标记后,探针离心缩小反应体积。杂交 mastermixII 可用来溶解探针。一些商品探针,如涂染探针,也可以用这种方法。按生产商的建议进行探针制备,例如,自 Vysis 购买的 DNA 探针,IfjtL 直接标记探针应加入 2pL 去离子水和 7pL 提供的 CEP 杂交缓冲液。 DNA 标记我们推荐使用 LifeTechnologies/Gibco 的 DNA 缺口平移标记试剂盒结合生物素、地高辛或荧光染料,如绿色或橙色进行 DNA 标记。每次反应,IpgDNA 探针在 15°C 标记 lh。标记物经 Sephadex050 分离柱上样后离心。1% 琼脂糖凝胶上样 5|uL 缺口平移标记探针,检测探针片段的长度,长度应为 200?800bp,大部分在 300?600bp。 沉淀标记的 DNA 探针1.向 I.5 mL Eppendorf 离心管中加入下述试剂,并在-70°C 放置 30 min:5~10ul 标记 DNA、5ug 人 Cot-1DNA、人胎盘 DNA、3ug 鲑鱼精子 DNA、1/10 体积的 3mol/L NaOAc(pH5.2) 和 2.5倍体积的 100% 乙醇。 2.4°C 下 13OOOg 离心 30 min。 3.弃去上清,加入 2 倍体积的 70% 乙醇溶解剩余的盐,13OOOg 离心 10min。 4.室温下晾干。 5.10uL 杂交 mastermixI 或 mastermixII,混匀,溶解探针。 杂交如果进行的是单抗原免疫表型,将进行双色 HSH(生物素和地高辛探针)。在双色 FISH 中,等量的地高辛和生物素探针一起沉淀,与细胞杂交。当进行的是双重免疫表型时,只要用地高辛探针进行一次 FISH 杂交即可(见注释 5)。 1.2~3uL 含有 DNA 探针的杂交混合物滴加到杂交区域。 2.盖上 12 mm 盖片。 3.橡皮泥封片,让其干燥 4.将标本片放在铺有湿纸巾的金属盒底,盖好金属盒,将其置于 76°C 水浴中 5 min(见注释 6)。 5.将金属盒转入 37°C 温箱。根据 DNA 探针的类型,选择杂交数小时、过夜或几天。重复序列探针,杂交只需要 2 h,而 cDNA 探针或染色体涂染探针,杂交则需要 2 天。 杂交后洗脱1.除去橡皮泥。 2.将标本片在预热的 0.1XSSC 缓冲液(pH7.0,60°C) 中将盖片轻轻地滑掉(见注释 7)。 3.0.1XSSC 洗片 3 次,每次 5 min。 4.标本片在 PN 缓冲液中于室温下浸泡 3 min。 杂交信号的检测下述实验方法用于检测双色探针(生物素和地高辛)。同时进行双重免疫表型和 FISH 时,只用地高辛探针杂交。检测生物素探针的抗体的步骤如 AMCA-亲和素和生物素标记的山羊抗亲和素,可以省略(见注释 5)。 1.将 AMC 标记的亲和素和单克隆鼠抗地髙辛抗体(分别用 PNM 缓冲液 1:100 稀释)混合物室温下孵育 25 min。 2.用 PN 缓冲液于室温下洗片 3 次,每次 5 min。 3.将生物素标记的羊抗亲和素抗体和地高辛标记的羊抗鼠抗体(分别用 PNM 缓冲液 1:100 稀释)混合物室温下孵育 25 min。 4.用 PN 缓冲液于室温下洗片 3 次,每次 51^11。 5.将 AMC 标记的亲和素和 FITC 标记的羊抗地高辛抗体(分别用 PNM 缓冲液 1:100 稀释)室温下孵育 25 min。 6.用 PN 缓冲液于室温下洗片 3 次,每次 5 min。 7.用抗淬灭剂封片。如果实验中只有红绿荧光染料,封片前应将标本片在 DAPI 溶液中染 2 min,2XSSC 漂洗。复染可以帮助确定杂交信号在细胞核中的位置。 四、图像保存和评估免疫表型和 FISH 结果根据使用的单色、双色或三色荧光滤片系统,免疫表型和 FISH 结果可以同时或依次观察。结果可以用髙速胶片(ASA400) 或数字成像系统进行拍摄。对于免疫表型的结果,分辨真假信号是很重要的。一般来说,真信号明亮新鲜,而假信号则模糊微弱或者极其的明亮。FISH 分析细胞的免疫表型,只能对完整的没有重叠的细胞进行评估。我们一般一张标本可以分析至少 50 个阳性结果细胞和超过 1 〇〇个阴性结果细胞。比较重要的是,结果评估应该由另一个独立的观察者来完成。 注释1.免疫表型实验中,单克隆鼠抗人 CD 抗体和多克隆 Cy3 和 AMCA 交联抗体都用 PNM 缓冲液以 1:50?1:200 的比例稀释。根据抗体质量和细胞中抗原表达水平确定适宜的抗体浓度。例如,在 T 淋巴细胞中高表达的 CD3 只需要与第一种或第一和第二种抗体孵育就可以轻易检测到。应该对每种新购买的抗体进行对照实验以确定其最适浓度。一般来说,Cy3 和 FITC 是强的可靠的染料,而 AMCA 比较弱,不稳定。Cy3 检测免疫表型的结果可以数周甚至数月后观察,而 AMCA 的信号很快淬灭。FITC 的标本片不能多日后检测,因为细胞的自发荧光将背景染色。 2.免疫表型后再次固定,可以使用 1% 或 4% 的多聚甲醛。多聚甲醛可以在 4°C 储存 2 周以上,而 Camoy 固定液必须每次使用前新鲜配制。缓冲液的固定时间对于成功完成实验非常重要。细胞固定的时间越短,荧光信号损失的越多。然而太长的固定时间将导致 FISH 杂交效率的大幅度降低。 3.免疫表型中,为排除错误的阴性结果,必须进行阴性对照实验。对照实验中任何荧光信号都应没有杂信号干扰。将单抗或基础抗体用水、PBS 或无关的同型抗体作为阴性对照。为排除干扰杂交或不同动物来源多克隆抗体的干扰,对照实验片应进行双重免疫表型实验。 4.在双重免疫表型实验中,与含有高浓度鼠免疫球蛋白的 20% 正常鼠血清孵育是成功进行第二次免疫表型的关键。兔抗鼠抗体的自由位点被封闭,不能与第二鼠抗人抗体(如 CD8) 结合。这次孵育后不需要洗片。双重免疫表型细胞进行 FISH 杂交,不使用生物素标记的抗体,因为它们会与第二单克隆鼠抗人抗体非特异性结合。 5.因为彩色荧光的限制,很难在一个实验中结合三种荧光颜色,如绿 FITC、红 Cy3、蓝 AMCA0 事实上,蓝色的 AMCA 荧光非常弱,而且不稳定,只能用在重复序列探针上。另一方面,FITC 比 Cy3 信号强度降低得快,而且与背景的对比度将降低。因此,我们建议使用 Cy3 交联抗体检测表达量低的抗原或位置小的特异性 DNA 探针。 6.我们没有发现分别变性和同时变性的细胞 DNA 和探针的结果有什么不同。许多实验室采用靶细胞 DNA 和探针 DNA 分别变性,随后 DNA 探针与人 Cot-1DNA 进行预复性。我们认为同时变性比较快速简便,结果与分别变性差不多。 7.在 FISH 研究中,我们发现在 0.IXSSC 中 60°C 进行 3 次杂交后洗脱,其洗脱效率与 42°C50% 甲酰胺/2XSSC 的差不多,而前者便宜、无毒。 |