酶联免疫吸附（ELISA）实验
| 实验方法原理 |
图1：竞争法测抗原示意图
这种方法所测定的抗原只要有一个结合部位即可，因此，对小分子抗原如激素和药物之类的测定常用此法。该法的优点是快，因为只有一个保温洗涤过程。但需用较多量的酶标记抗原为其缺点。 |
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| 实验材料 | |
| 试剂、试剂盒 | |
| 仪器、耗材 | |
| 实验步骤 | 一、包被抗体：用包被缓冲液稀释特异性抗体球蛋白至最适浓度（1～10 ug /ml），每凹孔加0.3 ml，4℃过夜，或37℃水浴3小时，贮存冰箱。
二、洗涤：移去包被液，凹孔用洗涤缓冲液（含0.05%吐温-20）洗3次，每次5分钟。 三、分2组，a组加酶标记抗原和被检抗原混合液0.2 ml，b组只加酶标记抗原液0.2 ml，37℃作用1～2小时。（混合液可作成不同稀释度） 四、洗涤：移去包被液，凹孔用洗涤缓冲液（含0.05%吐温-20）洗3次，每次5分钟。 五、加入0.2 ml底物溶液于每个凹孔(OPD或OT)，室温作用30分钟（另作一空白对照，0.4 ml底物加0.1 ml终止剂）。 六、加终止剂：每凹孔加2 M H2SO4或2 M柠檬酸0.05 ml。 七、用酶标比色计测定a、b两组OD值，并求出a、b、OD值的差数。 展开 |
| 其他 | 一、影响ELISA的因素
S / X ＝ CV ，CV应低10%，不应大于10～15%。
不论目测或分光光度计测定，均可作一个稀释度或一系列稀释度测定，一般常规诊断只用一个稀释度判断阳性或阴性就可以了，这样比较方便，现在推荐传染病的血清诊断用1：200一个稀释度。有些需要精确定量的，可作一系列稀释度测定。
记录结果有下列几种方法：
1、“+”或“-”：所有超过规定的OD值（如OD，0.4）的标本均属阳性，此规定OD值是根据事先测定大量阴性标本所取得的，此规定值是阴性标本的上限。或者以一组阴性标本OD平均值加2～3个标准差作为阳性阈值。
2、直接以OD值来表示，如0.4、0.7、1.2，OD值越大，阳性反应越强，但此数值是在固定实验条件下得到的结果，而且每次实验都要有参考标本作对照。
3、以终点滴度表示：将标本作连续稀释，最高稀释度能出现阳性反应者（即OD值仍大于阳性阈值，即为该标本的滴度。
4、以“比值表示：求出被检标本的OD值与一组阴性标本OD值的比值，例如为阴性标本的2倍或3倍，即为阳性，比值小于2.1而大于1.5为可疑，<1.5为阴性。
测定标本OD值-空白OD值
阴性对照OD值-空白OD值
如在此测定时以空白校正“O”点。
5、以“单位”来表示：在测定被检标本的同时，再测定一个含已知单位数的阳性参考血清，用不同稀释度作ELISA检测后，以OD值为纵坐标，单位数为横坐标，画出标准曲线。以后可根据被检标本的OD值，从曲线上找出相应的单位数，再乘于血清的稀释倍数，即可得出被检标本的单位数。
作试验时的阴性参考血清最好不要显色，否则会对结果判断带来困难，特别在目测时，当阳性标本OD值>2.0时，应作适当稀释后再作测定。
2. 对使用仪器要求 展开 |
