酶联免疫吸附实验（ELISA）
一、实验目的：
酶联免疫吸附试验是免疫酶技术的一种，免疫酶技术属于三大标
记技术之一，掌握该试验的原理和主要技术，了解三大标记技术的异同及各自的主要应用。
二、实验原理：
酶联免疫吸附试验（ELISA）是应用酶标记的抗体（或抗原）在固相支持物表面检测未知抗原（或抗体）的方法。酶与抗体（或抗原）交联后，再与集合结合在固相支持物表面的相应抗原或抗体反应，形成酶标记抗体-抗原复合物，此时加入酶底物和显色剂，在酶催化底物液体后呈现显色反应，液体显色的强弱和酶标记抗体-抗原复合物的量成正比，借此反映出待检测的抗原或抗体量。
酶联免疫吸附试验是利用抗原-抗体的免疫学反应和酶的高效催化底物反应的特点，具有生物放大作用，所以反应灵敏，可检出浓度在ng水平。在免疫反应部分，抗原-抗体的亲和力、抗原和半抗原的性质、测定方法的实验条件、酶标记物的性质等因素影响反应的敏感性。在酶学反应部分，酶的浓度、底物的浓度、反应pH和温度、酶的抑制剂和激活剂等因素液影响反应的敏感性。
酶联免疫吸附试验中所使用的试剂都比较稳定，按照一定的实验程序进行测定实验结果重复性较好，有较高的准确性。酶联免疫吸附法成本低，操作简便，可同时快速测定多个样品，不需要特殊的仪器设备。ELISA法测定技术与其他技术结合发展成为专门的分析方法，如与电泳技术结合的免疫印迹技术，与层析技术结合的层析-ELISA技术等已成为生物实验室的常规技术。
三、试剂与器材：
1. 聚苯乙烯微量细胞培养板(平板, 48, 96孔)。
2. 酶联免疫检测仪
3. 辣根过氧化物酶羊抗兔IgG, 工作稀释度1:1000。
4. 包被液:：0.05mol/L pH9.6碳酸缓冲液,4℃，保存,
Na2CO3 0.15克, NaHCO3 0.293克,蒸馏水稀释至100 ml。
5. 稀释液：0.01mol/LpH7.4 PBS--Tween--20, ４℃，保存. NaCl 8g, KH2PO4 0.2g, Na2HPO4.12H2O 2.9g, Tween—20，0.5ml. 蒸馏水加至1000ml。
6. 洗涤液：同稀释液
7. 封闭液：0.5%鸡卵清蛋白，pH7.4 PBS。
8. 邻苯二胺溶液(底物)：临用前配制 0.1M 柠檬酸(2.1g/100ml), 6.1ml 0.2M Na2HPO4.12H2O
(7.163g/100ml)
6.4ml, 蒸馏水12.5ml, 邻苯二胺10mg, 溶解后, 临用前加30%H2O2 40 微升。
9. 终止液：2mol/LH2SO4。
四、操作方法：
1.包被抗原：用包被液将抗原作适当稀释, 一般为1～10微克/孔，每孔加200微升，37℃温育1小时后，4℃冰箱放置16～18小时。
2. 洗涤：倒尽板孔中液体，加满洗涤液，静放三分钟，反复三次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽。
3. 加封闭液200微升，37℃放置一小时。
4. 洗涤同2。
5. 加被检血清：用稀释液将被检血清作几种稀释,，每孔200微升。同时作稀释液对照。37℃放置2小时。
6. 洗涤同2。
7. 加辣根过氧化物酶羊抗兔IgG, 每孔200微升, 放置37℃ 1小时。
8. 洗涤同2。
9. 加底物：邻苯二胺溶液加200ml，室温暗处10--15分钟。
10. 加终止液：每孔50微升。
11. 观察结果：用酶联免疫检测仪记录490nm读数。
五、关键步骤与注意事项：
1、酶标记抗体以及待检样本的使用浓度应事先滴定
2、保存的血清切忌反复冻融，以免降低血清中抗体或抗原的免疫学活性。
3、酶-底物反应时间除人为规定（常规规定为30分钟）外，还可以阳性参考标本的OD值达到1.0时为反应终点。
4、底物液一定要在临用前现配。
