细菌标本形态学检验常用技术和方法
细菌标本形态学检验常用技术和方法:形态学检查方法是细菌检验中极为重要的鉴定手段之一，它不仅有助于细菌的初步识别，同时也是决定进行生化反应鉴定的重要步骤。如痰中的抗酸杆菌、脑脊液中脑膜炎球菌、泌尿生殖道分泌物中的淋球菌等。通过形态学检查得到初步的诊断。由于细菌体积小，无色透明， 因此利用光学显微镜直接检查只能观察到细菌的动力，对形态、大小、排列方式、染色特性及特殊结构的判定，还须借助于染色标本的观察。要研究其细菌的超微结构，还需用电
形态学检查方法是细菌检验中极为重要的鉴定手段之一，它不仅有助于细菌的初步识别，同时也是决定进行生化反应鉴定的重要步骤。如痰中的抗酸杆菌、脑脊液中脑膜炎球菌、泌尿生殖道分泌物中的淋球菌等。通过形态学检查得到初步的诊断。由于细菌体积小，无色透明， 因此利用光学显微镜直接检查只能观察到细菌的动力，对形态、大小、排列方式、染色特性及特殊结构的判定，还须借助于染色标本的观察。要研究其细菌的超微结构，还需用电子显微镜。
一、不染色标本检查法
不染色标本的检查用于观察活菌状态，常用以检查细菌的动力或运动状况。
1．湿片法：用接种环取细菌培养液两环， 置于载玻片中央，轻轻覆以盖玻片。菌液要适量，不可外溢，不可有气泡。高倍镜下观察。
2．悬滴法：加一小滴菌液在盖玻片中央，在另一凹玻片凹窝的周围涂少量凡士林，将凹面向下，对准盖玻片中央，盖在凹玻片上，迅速翻转玻片，用小镊子轻压，使盖玻片与www.med126.com凹玻片粘紧，密封凹窝边缘。高倍镜下观察。
3．毛细管法：本法适用于观察厌氧菌动力。先将待检菌接种在适宜的液体培养基中，经厌氧过夜培养后，以毛细管（长60～70nm ，管径0．5 ～1．0nm ) 接触培养物，使菌液进入毛细管中，用火焰封闭毛细管两端，将毛细管固定在载玻片上，镜检。
二、染色标本检查法
（一) 基本方法
细菌胞浆无色透明，不易识别。常用适宜的染料使细菌着色后，以观察其形态和特殊构造，且可按染色反应进行分类。
1．原理
（1) 物理吸附作用：由于毛细管现象和渗透作用， 使染料进入细胞内被溶解吸收。此外，细菌等电点较低，pH值2 ～5，在一般情况下细菌带负电荷，易和带正电荷的碱性染料相结合。
（2) 化学反应：菌体内某些化合物和染料相结合，发生化学反应使细菌着色，而且不易被脱色剂所脱色。
（3) 其他因素：细胞膜的通透性、膜孔的大小、细胞结构完整与否以及培养基成分，染色液中电解质含量、pH值、菌龄等都是影响细菌着色的因素。
2．方法
（1) 涂片：临床标本大多可直接涂抹在洁净的载玻片上。若是细菌的液体培养物，可直接加一小滴在载玻片，稍加涂布。若是从固体培养基上取细菌菌落，则应先用接种环取一环生理盐水置于玻片上，然后从培养基上取少许菌在盐水中轻轻磨匀，使呈轻微乳白浑浊，再涂布扩大至直径20 mm 大小的圆形，待自然干燥，也可加微热使其干燥。
（2) 固定：涂片干燥后，在火焰上迅速通过3 次加以固定。固定过程可杀死细菌，凝固细胞质和其他细胞结构，增加细菌细胞对染液的通透性，还可使细菌涂膜牢固，不被在染色过程中的流水冲洗脱落。
（3) 染色：一般用低浓度染色液（1％以下)，滴加染液覆盖涂膜。分单染法和复染法。为促使染料与菌体结合，有的染色法可在染液中加入酚、明矾，有的在染色过程中加碘液，可起到媒染的作用，也有用加热法促进着色的。
（4) 脱色：一般应用乙醇、丙酮或酸类作为脱色剂。适当掌握脱色时间以获良好的效果。脱色剂可以显示出细菌与染料结合的牢固程度，具有鉴别染色的作用。
（5) 复染：复染液应与初染液的颜色不同，以形成鲜明对比。复染可使已脱色的细菌重新着色。
（二) 常用染色法
1．单染法
即用一种染液染色的方法。
（1) 染液①吕氏亚甲蓝液：以亚甲蓝乙醇饱和溶液（乙醇100 ml 含亚甲蓝2～5g)30 ml 加蒸馏水100 ml 及10％氢氧化钾0．1 ml 混合即成。②稀释石炭酸复红液：以碱性复
红乙醇饱和液（乙醇100 ml 含碱性复红3～7g)10 ml 与5％石炭酸液90 ml 混合， 配成石炭酸复红染液。再将此染液以蒸馏水作10 倍稀释即成。
（2) 方法：在已固定的细菌涂片上滴加吕氏美蓝液或稀释石炭酸复红，染1 分钟，水洗，干后镜检。
（3) 结果：以吕氏亚甲蓝染色， 菌体呈蓝色。以稀释石炭酸复红染色，菌体呈红色。
2．革兰染色法
为最常用的细菌复染法。
（
1) 染液：第一液：取结晶紫乙醇饱和液（乙醇100 ml 含结晶紫7 ～14g)20 ml 与医学全在,线1 ％草酸铵水溶液80 ml 混合过滤即成。第二液：碘1g ，碘化钾2g ，加少量蒸馏水，充分振摇，溶解后加水至300 ml 。第三液：95 ％ 乙醇或用乙醇、丙酮（7 ∶3) 混合液。第四液：稀释石炭酸复红液（同单染法) 或沙黄溶液（2．5 ％沙黄乙醇液10 ml 加水90 ml)。
（2) 方法：将第一液滴加在已固定的细菌涂片上，染1 分钟，水洗。再以第二液媒染1 分钟，水洗。继以第三液脱色。轻摇玻片，到无紫色脱落为止，水洗。最后以第四液复染0．5 分钟，水洗，干后镜检。
（3) 结果：革兰阳性菌呈紫色，革兰阴性菌呈红色。
3．抗酸染色法
（1) 染液：①石炭酸复红染液：同单染法，但不需用蒸馏水稀释。②脱色剂：为盐酸乙醇。③复染液（吕氏亚甲蓝液) 同单染法。
（2) 方法：在涂片上滴加石炭酸复红染液，玻片远离火焰使微微加热而有蒸汽，染液因蒸发而减少，需随时补加染液，防止干涸。如此维持5 分钟。待冷后，水洗。滴加脱色剂，轻摇玻片，到无红色流出为止，脱色时间约1 分钟。水洗。再滴加复染液复染0．5 分钟，水洗。干后镜检。
（3) 结果：抗酸菌呈红色，背景及其他细菌呈蓝色。
4．金胺染色法
（1) 染液：① 金胺“O ” 染液： 金胺“O ”0．1g 溶于95 ％ 乙醇10 ml，另取石酸3 ml 加水87 ml 中。将上述两液混匀（若有浑浊，不必过滤)，装人褐色瓶中，保存在室温中。②0．5 ％盐酸乙醇。③0．5 ％高锰酸钾液。
（2) 方法：在细菌涂片上加金胺“O” 染液，染15 分钟，水洗后用0．5 ％盐配乙醇脱色2 分钟，水洗，再加0．5 ％高锰酸钾液作用3 分钟，水洗， 待干，用荧光显微镜观察。
（3) 结果：抗酸菌呈亮黄色荧光。
5．阿尔培（Albert) 异染颗粒染色法
（1) 染液：第一液： 甲苯胺蓝0．15g ， 孔雀绿0．2g 溶于95 ％ 乙醇2 ml 中， 加水100 ml 及冰乙酸1 ml ，静置24 小时，滤纸过滤。第二液：碘化钾3g 溶于蒸馏水10 ml ，加
碘2g ，溶解后再加水至300 ml 。
（2) 方法：在涂片上加第一液染色3 ～5 分钟，水洗后第二液染色1 分钟，水洗，待干后镜检。
（3) 结果：异染颗粒呈蓝黑色，菌体呈绿色。
6．奈瑟（Neisser) 异染颗粒染色法
（1) 染液：第一液：亚甲蓝100 mg 溶于无水乙醇2 ml 中，加入5 ％冰乙酸98 ml ，充分混合，过滤。第二液：俾斯麦褐1g 溶于无水乙醇10 ml 后，加水至100 ml ，充分混合。过滤。
（2) 方法：在细菌涂片上滴加第一液，染色30 秒至1 分钟，水洗后，再以第二液染色30 秒至1 分钟，水洗，干后镜检。
（3) 结果：白喉杆菌菌体染成淡黄褐色，异染颗粒呈深蓝色。
7．黑氏（Hiss) 荚膜染色法
（1) 染液：①结晶紫染色液：结晶紫乙醇饱和液5ml 加水95ml 。②20 ％硫酸铜水溶液。
（2) 方法：细菌涂片自然干燥后用乙醇固定。滴加结晶紫染液，加温染1 分钟，不
用水洗，用20 ％硫酸铜溶液中冲洗后，以吸水纸吸干镜检。
（3) 结果：菌体呈紫色，荚膜为淡紫色或无色。
8．奥尔特（Olt) 荚膜染色法
（1) 染液：30 ％沙黄水溶液（乳钵研磨溶化)。
（2) 方法：在细菌涂片上滴加染液，用火焰加温染色3 分钟，冷后水洗， 待干后镜检。
（3) 结果：菌体呈褐色，荚膜呈黄色。此法主要用于炭疽杆菌的荚膜染色。
9．芽胞染色法
（1) 稀释石炭酸复红液（同单染法)，95 ％乙醇，碱性亚甲蓝液（同单染法)。
（2) 方法：滴加石炭酸复红液， 加温染5 分钟，水洗后用乙醇脱色2 分钟，水洗，滴加亚甲蓝液染1 分钟，水洗，待干镜检。
（3) 结果：菌体呈蓝色，芽胞呈红色。
10．魏—张鞭毛染色法
（1) 染液：饱和钾明矾液5 ml ，5 ％石炭酸液5 ml ，20 ％鞣酸液2 ml ，三者相互混合。临用时加碱性复红乙醇饱和液1 ml ，混合后静止过夜，次日过滤后使用。此染液以
3 天内使用效果最佳。
（2) 方法：①先将细菌在肉汤培养基中传代6 ～7 次。② 取出斜面培养基管内的凝结水，换以无菌生理盐水2 ml 。③取细菌的肉汤培养物一环，接种在斜面琼脂与护士招聘网盐水交界处，再自该部向上划一直线。④ 在35 ℃ 培育7 ～16 小时， 若为变形杆菌， 则放在22 ℃～25 ℃下培育16 小时。⑤以接种环自交界处取出一环菌液，轻放在加有3 ～4 ml 水的小碟表面，使细菌自由分散，浮在表面，静置在温箱内4 ～5 分钟。⑥ 用接种环自液面取一环菌液，放在高度洁净无油的载玻片上， 切勿研磨和摇动。置37 ℃温箱内让其自干，不能以火焰固定。⑦滴加染液染色0．5 至1 分钟，水洗，待干镜检。
（3) 结果：菌体鞭毛均呈红色。
（4) 注意事项：①鞭毛染色的细菌需新鲜的培养物。②涂片的制作不可用接种环转动涂抹，应将细菌轻轻加在玻片上，防止鞭毛脱落。③载玻片要求高度洁净。
11．负染色法
本法使背景着色而菌体不着色。用以观察细菌及某种真菌的荚膜。
（1) 墨汁染色：用接种环取一环菌液（108 ～1010／ml) 放在洁净载玻片上， 然后在相距2 ～3 m m 处放已稀释2 ～3 倍的绘图用墨汁—接种环。覆盖盖玻片后镜检。也可将墨汁1 滴与待检标本1 滴混合于载玻片上的一端， 以作血膜推片的方法制片， 干后镜检。可见背景成黑褐色，菌体无色。
（2) 刚果红染色：在载玻片上置2 ％刚果红水溶液1 小滴， 以极少量的培养菌与其混合，涂成均匀厚片，待干，以1 ％盐酸乙醇洗涤，待自然干燥后镜检。可见背景为蓝色，菌体无色。
