染色质免疫共沉淀(ChIP)
实验方法原理 |
在保持组蛋白和DNA联合的同时,通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体,染色质被切成很小的片断,并沉淀下来。 IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A”特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。 目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上,使之与含有抗原的溶液及抗体反应后,beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。 |
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实验材料 | 细胞样品 |
试剂、试剂盒 | 甲醛 甘氨酸 PBS SDS Lysis Buffer 洗脱液 RNaseA 蛋白酶K omega胶回收试剂盒 |
仪器、耗材 | 离心管 超声仪 电泳仪 离心机 |
实验步骤 |
一、细胞的甲醛交联与超声破碎(第一天)
1. 取出1平皿细胞(10 cm平皿),加入243 ul 37%甲醛,使得甲醛的终浓度为1%(培养基共有9 ml)。
2. 37℃孵育10 min。
3. 终止交联:加甘氨酸至终浓度为0.125 M。450 ul 2.5 M甘氨酸于平皿中。混匀后,在室温下放置5 min即可。
4. 吸尽培养基,用冰冷的PBS清洗细胞2次。
5. 细胞刮刀收集细胞于15 ml离心管中(PBS依次为5 ml,3 ml和3 ml)。预冷后2 000 rpm 5 min收集细胞。
6. 倒去上清。按照细胞量,加入SDS Lysis Buffer。使得细胞终浓度为每200ul含2x106个细胞。这样每100 ul溶液含1x106个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。假设MCF7长满板为5x106个细胞。本次细胞长得约为80%。即为4x106个细胞。因此每管加入400 ul SDS Lysis Buffer。将2管混在一起,共800 ul。
7. 超声破碎:VCX750,25%功率,4.5 s冲击,9 s间隙。共14次。
二、除杂及抗体哺育(第一天)
1. 超声破碎结束后,10 000 g 4℃离心10 min。去除不溶物质。
2. 留取300ul做实验,其余保存于-80℃。
3. 300 ul中,100 ul加抗体做为实验组;100 ul不加抗体做为对照组;100 ul加入4 ul 5 M NaCl(NaCl终浓度为0.2 M),65℃处理3 h解交联,跑电泳,检测超声破碎的效果。
4. 在100 ul的超声破碎产物中,加入900 ul ChIP DilutionBuffer和20 ul的50xPIC。
再各加入60 ul ProteinA Agarose/SalmonSpermDNA。4℃颠转混匀1 h。
5. 1 h后,在4℃静置10 min沉淀,700 rpm离心1 min。
6. 取上清。各留取20 ul做为input。一管中加入1 ul抗体,另一管中则不加抗体。4℃颠转过夜。
三、检验超声破碎的效果(第一天)
1. 取100 ul超声破碎后产物,加入4 ul 5M NaCl,65℃处理2 h解交联。
四、免疫复合物的沉淀及清洗(第二天)
1. 孵育过夜后,每管中加入60 ul ProteinA Agarose/SalmonSperm DNA。4℃颠转2 h。
2. 4℃静置10 min后,700 rpm离心1 min。除去上清。
3. 依次用下列溶液清洗沉淀复合物。清洗的步骤:加入溶液,在4℃颠转10 min,4℃静置10 min沉淀,700 rpm离心1 min,除去上清。
洗涤溶液:
(2)highsalt wash buffer-one wash
(3)LiCl wash buffer-one wash
(4)TE buffer-two wash
4. 清洗完毕后,开始洗脱。
每管加入250 ul洗脱buffer,室温下颠转15 min,静置离心后,收集上清。重复洗涤一次。最终的洗脱液为每管500 ul。
5. 解交联:每管中加入20 ul 5M NaCl(NaCl终浓度为0.2 M)。
6. 混匀,65℃解交联过夜。
五、DNA样品的回收(第三天)
1. 解交联结束后,每管加入1 ul RNaseA(MBI),37℃孵育1 h。
2. 每管加入10 ul 0.5 M EDTA,20 ul1M Tris.HCl(PH6.5),2 ul 10 mg/ml蛋白酶K。45℃处理2 h。
3. DNA片段的回收----omega胶回收试剂盒。最终的样品溶于100 ul ddH2O。
六、PCR分析(第三天)
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注意事项 |
1. 注意抗体的性质。抗体不同和抗原结合能力也不同,免染能结合未必能用在IP反应。建议仔细检查抗体的说明书。特别是多抗的特异性是问题。 展开 |
其他 |
一、染色质免疫共沉淀简介 二、ChIP的一般流程
甲醛处理细胞---收集细胞,超声破碎---加入目的蛋白的抗体,与靶蛋白-DNA复合物相互结合---加入ProteinA,结合抗体-靶蛋白-DNA复合物,并沉淀---对沉淀下来的复合物进行清洗,除去一些非特异性结合---洗脱,得到富集的靶蛋白-DNA复合物---解交联,纯化富集的DNA-片断---PCR分析。
三、PCR分析
ChIP-chip在描述转录结合因子动力学中的研究、染色体结构组分的分布、在组蛋白的修饰、组蛋白修饰蛋白和染色体重建中的应用也十分广泛。ChIP-chip 技术的优点是,可以在体内进行反应;在给定的检验细胞环境的模式下得到DNA相互关系的简单影像;使用特异性修正抗体鉴定与包含有一个特异性后转录修正的蛋白质的相关位点;直接或者间接(通过蛋白质与蛋白质的相互作用)的鉴别基因组与蛋白质的相关位点。缺点是:需要一个特异性蛋白质抗体,有时难于获得;为了获得高丰度的结合片段,必须实验演示胞内条件下靶标蛋白质的表达情况;调控蛋白质的基因的获取可能需要限制在组织来源中。
总之,ChIP-chip 技术的发展为析活细胞或组织中DNA与蛋白质的相互关系提供了一个极为有力的工具。在未来的研究中,将对芯片的构建进行改进,提高其实用性。使用易于获得抗体,增加这种方法的可用性。
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