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新型超微量染色质免疫共沉淀ChIP-seq技术-Cut&Tag

2020.1.31

1.Cut&Tag原理

ChiTag是Protein A蛋白与Tn5转座酶的融合蛋白，当抗体结合目的蛋白（如转录因子、组蛋白等）后，Protein A蛋白可直接结合抗体，携带的Tn5转座酶可特异性的切割目的蛋白附近的DNA片段，并将DNA片段连上接头，文库构建后进行高通量测序。

图1 Cut&Tag实验流程图

2. Cut&Tag优势

为证明Cut&Tag技术的有效性，作者在对组蛋白H3K27me3进行研究时对比使用了ChIP-seq、Cut&RUN、Cut&Tag三种方法。从不同角度对三组数据进行比较后，发现Cut&Tag技术具有显著优势，具体结果如下：

（1）背景噪音低

为了直接比较这三种技术，作者将三种方法的数据量都设置为8M Reads，结果发现三种方法得出的峰图相似，但是ChIP-seq的背景噪声非常高，增加数据量到50M Reads时，才能达到类似的峰图，因此ChIP-seq需要更大的测序深度才能将染色质特征与背景区分开。相反，Cut＆RUN和Cut＆Tag均具有极低的背景噪声水平，其中Cut＆Tag的背景噪音最低。

图2 三种方法背景噪音比较

（2）信号值高，灵敏度好

为了量化三种方法的敏感性，作者分别检测了三种方法不同测序深度下峰的富集效率图，发现Cut＆Tag可以更快地填充低测序深度的峰，其中约2M Reads相当于Cut＆RUN的8M Reads或ChIP-seq的20M Reads，结果表明相同测序深度下，Cut＆Tag检测的信号值更高。同时，作者又分析了相同测序深度下（8M Reads），峰图形成的灵敏度，由于ChIP-seq的灵敏度相对较低，所以作者增加了一个40M Reads数据量下的峰图，比较后发现仍旧是Cut＆Tag峰图最显著，且比ChIP-seq的40M Reads峰图都高，表明Cut＆Tag的灵敏度最高。

图3 三种方法信号强度比较

（3）重复性好

为了检测三种方法的可重复性，作者分别对三种方法做了两次重复实验，并对实验结果进行分层聚类相关矩阵分析，证明了Cut＆Tag实验可重复性最好。

图4 三种方法重复性相关矩阵

总结

Cut&Tag是蛋白质-DNA互作关系研究的新方法，相较于传统的ChIP-Seq具有以下优点：所需细胞量少，背景信号低，可重复性好，无需ChIP级别抗体等优点，甚至可用于单细胞水平测序。Cut&Tag技术可从基因组范围内检测组蛋白、RNA polymerase II和转录因子等蛋白质结合的DNA区端，应用于临床和科研的表观遗传学研究，或是结合生物信息学分析，找到转录因子下游调控的靶基因，为进一步阐明生物学机制提供依据。

Cut&Tag（Cleavage Under Targets and Tagmentation）是蛋白质-DNA互作关系研究的新方法，是新一代超微量ChIP-Seq技术，适用于无ChIP级别抗体的蛋白研究。与传统的ChIP-Seq研究方法相比，该技术无需交联、超声打断、末端抹平和接头连接等操作，因此具有省时高效、所需样品量少、背景信号低和可重复性好等优点，甚至可用于单细胞水平测序。Cut&Tag有望将蛋白质-DNA互作的研究变成一种类似PCR反应的常规操作，对基因调控、表观遗传等领域的研究具有革命性的意义。

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