层析技术:生物化学实验常用技术(3)
一、基本原理
是指混合物随流动相流经固定相的层析柱时，混合物中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。固定相是凝胶。凝胶是一种不带电荷的具有三维空间的多孔网状结构，凝胶的每个颗粒内部都具有很多细微的小孔，如同筛子一样，小的分子可以进入凝胶网孔，而大的分子则被排阻于凝胶颗粒之外，因而具有分子筛的性质。当混合物样品加入到凝胶的层析柱中时，样品将随洗脱液的流动而移动。这时的样品一般作两种运动：一是随洗脱液垂直向下移动；二是作不定向扩散运动。分子量小的物质，在不定向扩散中可以进孔内部，然后再扩散出来，故流程长，通过柱子的速度慢，一般后流出层析柱；分子量大的物质，由于不能进入到凝胶孔内部，只能在凝胶颗粒之间移动，故流程短，先流出层析柱。这样，分子量大小不同的物质就会因此得到分离。凝胶孔隙中的水称内水，用Vi表示。凝胶颗粒空隙之间的水称外水，用Vo表示，层析柱中凝胶颗粒的体积用Vg表示，柱床的总体积以Vt表示，即
（1）完全排阻的大分子 （2）中等分子
（3）完全渗透的小分子 （4）吸附分子
二、常用凝胶的种类及特性
常用的凝胶主要有琼脂糖凝胶、交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖－葡聚糖复合凝胶等。
1．琼脂糖凝胶：是从琼脂中分离出来的天然凝胶，由D－半乳糖和3、6－脱水－L－半乳糖交替结合而成。其商品名因生产厂家不同而异，如Sepharose（瑞典）、
Sagavac（英国）、Bil-Gel（美国），每一品名又有不同的型号。琼脂糖凝胶的优点是凝胶不带电荷，吸附能力非常小。主要用于分离分子量40万以上的物质，如核酸、病毒等。
2．交联葡聚糖凝胶：其基本骨架是葡聚糖。瑞典出品的商品名为Sephadex，国产的商品名为Dextran。不同型号的凝胶用“G”表示，从G－25～G－200。“G”后面的数字表示每10克干胶的吸水量，“G”值越大，表示凝胶的网孔越大。可根据待分离混合物分子量的大小，选用不同“G”值的凝胶。
3．聚丙烯酰胺凝胶：由单体丙烯酰胺先合成线性聚合物，再以交联剂共聚交联而成。以 “P”表示，从 P－2～P－300。“P”后的数字×1000表示分子量的排阻极限。
4．琼脂糖－葡聚糖复合凝胶：商品名为Superdex，是把葡聚糖凝胶，通过交联剂交联到琼脂糖上，因此具有二者的优点。
三．影响凝胶柱层析的主要因素
1．层析柱的选择与装填 层析柱的大小应根据分离样品量的多少以及对分辩率的要求而定。凝胶柱填装后用肉眼观察应均匀、无纹路、无气泡。
2．洗脱液的选择 洗脱液的选择主要取决于待分离样品，一般来说只要能溶解被洗脱物质并不使其变性的缓冲液都可用于凝胶层析。为了防止凝胶可能有吸附作用，一般洗脱液都含有一定浓度的盐。
3．加样量 加样量的多少应根据具体的实验而定；一般分级分离时加样量约为凝胶柱床体积的1%～5%左右，而分组分离时加样量约为凝胶柱床体积的 10%～25%左右。
4．凝胶的再生：在凝胶或层析床表面常有一些污染，必需作适当处理。葡聚糖凝胶柱可用0.2N NaOH 和 0.5N NaCl的混合液处理，聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶遇酸、碱不稳定，故常用盐溶液处理。
亲和层析
生物体内有许多高分子化合物，具有和某些对应的专一分子可逆结合的特性。例如，酶蛋白和辅酶、抗原和抗体、激素与其受体等都具有这种特性。这种生物大分子和配基之间形成专一的可解离的络合物的能力称为亲和力。亲和层析的基本过程是，把欲分离的可亲和的一对分子的一方作为配基，在不伤害其生物功能的情况下，与不溶性载体结合使其固定化，然后装入层析柱。把含有欲分离物质的混合液作为流动相，在有利于固定相的配基和欲分离物质之间形成络合物的条件下进入亲和层析柱。这时，混合物中只有能与配基形成络合物的物质才被层析柱吸附，不能形成络合物的杂质从柱中直接流出。然后改变流过层析柱的溶液，促使配基与亲和物质解离，从而释放出亲和物质来。亲和层析的优点是条件温和、操作简单，专一性强、效率高，尤其是分离含量少而又不稳定的的活性物质最为有效。亲和层析的局限性是，不是所有的生物高分子都有特定配基，所以使用范围较窄；另外针对分离的对象必需制备专一的配基和选择特定的层析条件。
