乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）活力测定（比色法）
实验原理
乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase简称LDH，EC.1.1.1.27, L－乳酸：NAD+氧化还原酶）广泛存在于生物细胞内，是糖代谢酵解途径的关键酶之一，可催化下列可逆反应。
LDH可溶于水或稀盐溶液。组织中LDH含量测定方法很多，其中紫外分光光度法更为简单、快速。鉴于NADH, NAD+ 在340nm及260nm
处有各自的最大吸收峰，因此以NAD+为辅酶的各种脱氢酶类都可通过340nm光吸收值的改变，定量测定酶活力，如苹果酸脱氢酶、醇脱氢酶、醛脱氢酶、甘油－3－3磷酸脱氢酶等。
本实验测乳酸脱氢酶活力，是在一定条件下，向含丙酮酸及NADH的溶液中，加入一定量乳酸脱氢酶提取液，观察 NADH在反应过程中340 nm
处光吸收减少值，减少越多，则LDH活力越高。其活力单位定义是：在25℃，pH7.5条件下每分钟A340下降值为1.0的酶量为1个单位。
试剂和器材
试剂
50mmol/L pH6.5磷酸氢二钾－磷酸二氢钾缓冲液母液：
A: 50 mmol/L K2HPO4: 称K2HPO41.74g加蒸馏水溶解后定容至200mL。
B: 50 mmol/L KH2PO4: 称KH2PO43.40g加蒸馏水溶解后定容至500mL。
取溶液A 31.5mL ＋溶液B 68.5mL, 调节pH至6.5。置4℃冰箱备用。
10mmol/L pH 6.5磷酸氢二钾－磷酸二氢钾缓冲液用上述母液稀释得到。现用现配。
0.2 mol/L pH7.5磷酸氢二钠－磷酸二氢钠缓冲液母液：
A: 0.2 mol/L Na2HPO4: 称Na 2HPO4·12H2O 71.64g加蒸馏水溶解后定容至1000mL。
B: 0.2 mol/L NaH2PO4: 称NaH2PO4·2H2O 31.21g加蒸馏水溶解后定容至1000mL。
取溶液A 84 mL ＋溶液B 16 mL, 调节pH至7.5。置4℃冰箱备用。
0.1mol/L pH 7.5磷酸盐缓冲液, 用上述母液稀释得到。现用现配。
NADH溶液：称3.5mg纯NADH置试管中，加0.1mol/L pH7.5磷酸缓冲液1mL摇匀。现用现配。
丙酮酸溶液：称2.5mg丙酮酸钠，加0.1mol/L pH7.5磷酸缓冲液29mL, 使其完全溶解。现用现配。
二、材料
兔肉。
三、器材
组织捣碎机；移液管5mL（×2）, 0.1mL（×2）)；微量注射器10μl（×1）；恒温水浴；
分光光度计。
操作方法
一、制备肌肉匀浆
称取20g兔肉, 按W/V=1/4比例加入4℃预冷的10mmol/L pH 6.5磷酸氢二钾－磷酸二氢钾缓冲液，用组织捣碎机捣碎，每次10s，连续3次。将匀浆液倒入烧杯中，置4℃冰箱中提取过夜，过滤后得到组织提取液。
二、LDH活力测定
预先将丙酮酸溶液及NADH溶液放在25℃水浴中预热。取2只石英比色杯，在1只比色杯中加入0.1mol/L pH
7.5磷酸氢二钾－磷酸二氢钾缓冲液3mL，置于紫外分光光度计中，在340nm处将光吸收调节至零；另一只比色杯用于测定LDH活力，依次加入丙酮酸钠溶液2.9mL,
NADH溶液0.1mL，加盖摇匀后，测定340 nm光吸收值（A）。取出比色杯加入经稀释的酶液10μL，立即计时，摇匀后，每隔0.5min
测A340，连续测定3min，以
A对时间作图，取反应最初线性部分，计算每分钟A340减少值。加入酶液的稀释度（或加入量）应控制每分钟A340下降值在0.1－0.2之间。
三、数据处理
计算每毫升组织提取液中LDH活力单位：
LDH活力单位（U）/mL 提取液＝
注意事项
（1）实验材料应尽量新鲜，如取材后不立即用，则应贮存在－20℃冰箱。
（2）酶液的稀释度及加入量应控制每分钟A340下降值在0.1－0.2之间，以减少实验误差。
（3）NADH溶液应在临用前配制。
