细菌的临床检验
临床细菌学检验在检验医学中具有特殊的位置，主要表现在它的高风险性（如脑脊液培养结果正确与否直接关系到患者的生死）、高干扰性（如标本采集、运送等过程中的诸多因素都会干扰检出率和正确率）、高技术性和高严谨性（准确表达、报告和解释结果直接影响治疗的成败）。因此，细菌培养和药敏试验等属于高度复杂的试验范畴。
由于致病菌的多样性和变异性，临床细菌学始终是一门知识更新和发展较快的学科。为此，从事临床细菌检验的医师和技师必须具有较好的业务素质和敬业精神，要勤于学习和探索，要有严谨求实的作风和对新事物的敏感性，这是高质量完成细菌检验任务的首要条件。
细菌检验的全面质量管理是一个连续的质量管理过程，包括从患者准备，申请单书写，标本采集、标识、保存、运送、处理和检验，结果分析和报告，直至医师的理解和应用（诊治）。为了有效地对这一过程进行全面质量管理，本文从检验前、检验中和检验后三个方面提出相关要求。
检验前
（一）检验项目的申请
细菌检验项目的申请要有针对性和合理性。临床医师应在熟悉人体各部位正常菌群以及常见致病菌的基础上，结合感染患者的症状、体征，科学地提出检验申请。对于有感染迹象者（WBC增高，中性粒细胞升高，CRP>20mg/L等），应尽快申请做细菌培养与药敏试验，并力争在使用抗菌药物之前送检标本，以便及时获得致病菌的有关资料和药敏结果，正确选用抗菌药。对于低临床价值的细菌标本，如口腔和肠内容物、直肠周围脓肿、褥疮、多毛的脓肿、恶露、呕吐物、Foley导管尖等，由于易受正常菌群的污染，细菌培养价值较低，一般不做细菌培养；必须申请细菌培养时，其结果应结合临床分析。由于细菌检验的特殊性，细菌检验申请单必须提供临床信息，特别应说明患者是否使用过抗菌药以及使用过何种抗菌药，以便于实验室有的放矢地抵消抗菌药的作用，提高细菌培养阳性率。
（二）检验标本的采集、保存、运送和验收
1．患者的准备 主要包括两个方面：一是做好采集部位的清洁和消毒工作，防止正常菌群的污染；二是耐心细致地交待患者，使其主动配合以便采集到有价值的标本。
2．标本采集 标本正确采集十分重要，其目的是千方百计捕捉病原菌并保持其活性，以提高检出率，同时又要尽可能避免非病原菌的污染和干扰。为此，要根据各种感染性疾病和目标病原菌的不同特点，正确合理地确定采样部位、时机和次数。要选用恰当的采样器材并严格按规范操作。一般来讲，采样量多一些有利于病原菌的检出，但应以不影响患者健康和便于操作为前提，因此采样量要恰当。
3．标本保存与送检 盛标本的容器应无菌、不漏和便于密封。要根据目标病原菌的特点决定是否使用保菌液、运送液或增菌液，以及选择何种保菌液、运送液或增菌液。标本采集后应尽可能立即送检。如不能及时送检，要根据目标病原菌的特点确定保存条件（如温度等），在规定的时间内送到实验室。
4．验收和登记 标本的验收和登记要有专人负责。验收的内容主要包括：采样时间与送检时间（注意时间间距）以及送检条件是否符合保存致病菌活力的要求；盛标本容器是否有溢漏和污染；申请单是否填写完整；标本标识是否与申请单一致和唯一等。对不合格的标本要拒收，并向送检医护人员说明拒收原因，告知正确送检的要求，嘱其重新采集和送检标本。
以上各项均与细菌检验的质量密切相关，检验科（细菌室）应与临床科室通过共同研讨，认真制定有关的要求和标准操作程序，并严格执行。
检验中
（一）致病菌分离鉴定
1．标本（细菌）的接种、分离和鉴定
根据标本和检验目的的不同接种不同的培养基。对阳性培养要分离纯化，然后进行分群和种属鉴定。整个操作过程要按标准操作程序（SOP）进行，不得随意更改操作程序，对于疑难菌株，要查阅文献、组织会诊，不能草率作出结论。
2．检验过程的记录和结果报告
检验过程中所见现象和发现的问题，均应如实地记录，以便于分析实验结果，作出正确结论和发出可信的报告，亦可作为今后总结和改进工作的依据。所发报告内容要登记，以便查询；如原（初步）报告有误或不完善，应发纠正报告。
（二）药敏试验质控
药敏试验应严格按最新发布的NCCLS所规定的培养基、操作方法、药敏纸片和判定标准进行。为了监控试验过程的质量，必须做好药敏质控。
1．常用的药敏质控标准菌株
NCCLS从美国菌种收集中心（ATCC）选择推荐了一些菌株作为质控标准株（见表1）。
2．质控株的保存
尽管质控标准株比其他一些菌株药敏结果是相对稳定的，但反复多次的传代不可避免地会造成菌株的变异。为防止变异，必须将标准株冻干保存。每月从冻干株中复苏1次，种入大豆胰酶消化肉汤中（厌氧菌可用GAM肉汤等）作为工作株。工作株可存于4℃～8℃，并于每周转种1次。通常工作株转种4～5次后即须弃去。在质控中，如发现工作株结果有疑问，应予以更换。反复传代亦易使其敏感性变异，特别是铜绿假单胞菌（ATCC 27853），将会丢失对脲基青霉素的敏感性。如无冻干条件时，可将质控株置入：①含10～15%甘油的大豆胰酶消化肉汤，或②脱纤维羊（或兔）血，或③脱脂奶，或④含50%小牛血清的肉汤，存于-20℃以下环境中（最好－60℃以下），亦可防止变异。
3．药敏质控方法
质控株应每天随临床分离株一道进行药敏试验，质控株的药敏结果如果在质控允许范围内（参见最新CLSI文件），说明实验条件符合要求，结果可信；若药敏结果在质控允许范围外，则实验中可能存在差错。由于质控允许范围的最大值与最小值是质控株在标准条件下多次重复实验的95%可信限，故20次连续质控结果中仅允许1次落在范围外，但不能偏离质控允许范围中间值[（最大值+最小值）/2]4个标准差。由于允许范围恰好包括4个标准差，故落在允许范围外的抑菌圈直径一定要在离中间值一个允许范围（中间值±1个允许范围）之内。此外，20次或更多次药敏结果的平均值应接近中间值。如果20次连续质控结果中≥2次或30次中有≥4次结果超出了允许范围，则提示实验过程中存在问题，必须查找原因加以解决。常规的药敏质控可按下法进行：连续测定某药对质控株的药敏结果，每天一次，共测20或30天，取得20或30个值。⑴如果20个值中仅有一个值，或30个值中仅有三个以下的值超出允许范围，则结果基本可信，可改每天质控一次为每周一次。此后，若某周出现一次质控值超出允许范围，则于当天查找原因（包括用错纸片和质控株，菌株污染，孵育条件错误等），经纠正明显错误后重测，如结果在允许范围内可继续每周一次的质控；如未能找出明显原因则需采取立即纠正措施：连续质控五天，每天一次：①若五次结果皆在允许范围以内，则继续每周一次的质控；②五次结果只要有一次失控，则存在系统误差，需进行增加的纠正措施：查找到原因，然后改每周一次质控为每天一次，完成20（或30）天质控，其间失控次数若在一次（或三次）以内，则再改为每周一次。⑵如果有两个（或四个）以上的值超过允许范围，则继续做每天一次的质控。⑶每当改变试剂、药敏纸片和培养基等时，均要重新进行连续20（或30）天的质控。⑷每次失控均要查找原因，纠正后才能发出报告。
（三）培养基、试剂和染色的质控
1．培养基的质控
培养基的好坏直接关系到能否从标本中分离到病原菌，是否出现典型的生化反应现象等关键所在。我国大部分实验室都是自行制备，注意在培养基制备过程中应严格控制。制备后及使用前严格检查，妥善保存。标明制备日期、失效期、组成、名称批号等。
培养基的质控主要包括以下四个方面：①无菌试验，每批培养基在高压或过滤除菌后均要抽取样本进行培养，以证实无菌生长。②支持生长试验，以适宜的菌株接种，经培养应生长良好。③选择和抑制生长试验，对选择性培养基应至少分别选1株可生长、1株被抑制菌进行接种培养，可生长菌应生长良好，被抑制菌应不能生长。④生化反应培养基至少应分别选阳性和阴性反应菌株各1株，以证实应有的反应。常用的质控菌见表2，请正确选用。
2．生化反应试纸和试剂的质控
试纸和试剂无论是外购的还是自制的，在使用时一定要注明开启时间和失效期。测定代谢产物的试纸或试剂，要用已知阳性和阴性的菌株进行测试，并作好测试记录。测定代谢产物的试剂，要防止细菌的污染。
触酶、氧化酶、凝固酶试剂在开瓶时以及使用中，每天至少要分别用一阳性和阴性菌测试1次。杆菌肽、Optochin、ONPG、XV纸片（条）在开瓶时以及使用中，每周至少要分别用一阳性和阴性菌测试1次（XV纸片仅做阳性菌）。用于分枝杆菌鉴定的试剂在开瓶或配制时，以及每次使用时，均要做阳性菌对照（铁的摄取试验还要做阴性对照）。抗血清在开瓶时和使用中每月需分别用阳性反应和阴性反应菌做1次测试。抗原检测试剂和DNA探针在每次操作时，均要设阴、阳性对照。其他试剂和纸片仅在开瓶或配制时，做1次阴、阳性反应测试即可。各种常用试纸和试剂的质控菌和预期结果见表3。
3．染色的质控 常用染色的质控要求见表4
，质控结果应作好记录。
（四）仪器设备质量监测
实验室内的各种仪器设备的运行情况，应每天进行监测，每一仪器均要有专人按使用说明书要求进行维护保养，仪器上要附有运行记录卡，每天由维护保养人记录温度等指标的变化情况。一旦发现异常或失控，应立即查找原因并进行维修。
（五）积极参加室间质评
要按规定参加细菌学的室间质评，对实验室质控水平进行全面评估，不断提高检测水平。
检验后
检验工作完成后，要综合检验结果，正确及时地发出报告。阳性结果应先通知医师，以争取时间抢救患者。对于可疑的阴性结果或与临床不符的结果，要与医师共同探讨，找出可能的原因，不断提高诊断水平。对于所分离的特殊菌株，最好设法保存，以利于今后的研究工作。经常征求医护人员和患者的意见，加强相互间的沟通，重视医师和患者的投诉和抱怨，定期对质量管理工作进行评价，作出书面总结。要求全体检验人员都知道存在的问题和克服的办法，不断调整和改进质量管理体系。
