细菌内毒素的鲎试剂检查法
细菌内毒素检查法又称鲎试剂法,是利用鲎试剂与细菌内毒素发生凝集反应,以检测或量化药品中因革兰阴性菌产生的细菌内毒素含量是否符合规定的一种方法。此法以其快速、灵敏、经济、重现性好等特点得到了日益广泛的应用,并有取代传统的热原检查法的发展趋势。
1956年,美国动物学家Bang首先发现,给美洲鲎注入革兰阴性细菌后引起全身性
血液凝固。1968年,美国血液工作者Dr r. Levin与Bag初步阐明这种血液凝固是由于革兰阴性细菌内毒素激活了鲎血变形细胞溶解物的酶,使溶解物中的可溶性蛋白变成凝胶。这种凝固反应极其灵敏,当内毒素浓度达0001ug/ml即足以产生阳性结果。20世19纪70年代,美国提取变形细胞溶解物制成试剂,创建了检测微量内毒素的检测技术。
细菌内毒素检查包括两种方法,即凝胶法和光度测定法,后者又包括浊度法和显色基质法。供试品检测时,可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时,除另有规定外,以凝胶法结果为准。细菌内毒素的量用内毒素单位(EU)表示。
(一)标准品
细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价,用于试验中的鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。
(二)检查前的准备工作
1.试验器材处理试验所用的器皿需经处理,去除可能存在的外源性内毒素。常用的方法是在250℃干燥至少30分钟,也可用其他确保不干扰细菌内毒素检查的适
宜方法。若使用塑料器械,如微孔板和与微量加样器配套的吸头等,应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。
2.供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。一般要求供试品溶液的pH在6.0～8.0。
3.内毒素限值的确定药品、生物制品的细菌内毒素限值(L)一般按式 L=K/M确定。
式中,l为供试品的细菌内毒素限值,以EU/ml、EU/mg或EUU(活性单位)表示;K为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量,以EU/(gh)表示;M为人用每千克体重每小时最大供试品剂量,以m(kgh)、m/(kgh)或U/(kgh)表示,人均体重按60kg计算,注射时间若不足1小时,按1小时计算。
4.确定最大有效稀释倍数(MVD)最大有效稀释倍数(MVD)是指供试品溶液被
允许稀释的最大倍数,在不超过此稀释倍数下可进行内毒素限值的检测。一般按式MVD=CL/λ确定 。
式中,L为供试品的细菌内毒素限值;C为供试品溶液的浓度,当L以EU/ml表示时,则C等于1.0ml/ml,当L以EU/mg或EU/U表示时,C的单位需为mg/ml或U/ml为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度(EU/ml),或是在光度测定法中所使用的标准曲线上最低的内毒素浓度。
(三)检查方法凝胶法
凝胶法是一种限量法,是经典的细菌内毒素检查法。凝胶法系指通过鲨试剂与内0毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。在本检查法规定的条件下,使截试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为试剂的标示灵敏度,用Eml表示
1.试剂灵敏度复核试验当使用的试剂批号改变或试验条件发生了改变可能会影响检验结果时,需要进行试剂灵敏度复核试验。在细菌内毒素检查法规定的条件下,能使鲎试剂产生凝集的标准内毒素的最低浓度称为灵敏度。单位为EU/ml。常用鲎试剂的灵敏度:0.5EU/ml、0.25EU/ml、0.125EU/ml、0.06EU/ml、0.03EU/ml。
根据鲎试剂灵敏度的标示值(λ),将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解,然后制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ共4个浓度的内毒溶液。《中国药典》二部要求将细菌内毒素国家标准品用细菌内毒素检查用水溶解后需要在旋涡混合器上混匀15分钟,以后每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒。
在16支试管中分别加入0.1ml不同浓度的内毒素标准溶液,即每一个浓度平行做4支试管;在2支试管中加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照将试管中溶液轻轻混匀后,封闭管口,垂直放入37℃±1℃适宜恒温器中,保温60分钟±2分钟。将试管从恒温器中轻轻取出,缓缓倒转180°,若管内形成凝胶,并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性;未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性。保温和拿取试管过程中应避免受到振动,造成假阴性结果。
若最大浓度2管均为阳性,最低浓度0.5管均为阴性,阴性对照管为阴性,试验方为有效。按式计算反应终点浓度的几何平均值,即为试剂灵敏度的测定值(λc)
式中
,为反应终点浓度的对数值(lg)。反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。
当λ在0.5λ～2λ(包括0.5λ和2λ)时,方可用于细菌内毒素检查,并以标示灵敏度为该批鲎试剂的灵敏度。
2.干扰试验内毒素试验是试剂在无干扰的条件下与内毒素的一种凝集反应,当进行新药的内毒素检查试验前,或无细菌内毒素检查项的品种建立内毒素检查法时须进行干扰试验;当鲎试剂、供试品的配方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时,须重新进行干扰试验。试验方法如下。
(1)按表1制备溶液A、B、C和D,使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过最大有效稀释倍数(MVD)的溶液,按照鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。
(2)当溶液A和阴性对照溶液D的所有平行管都为阴性,并且系列溶液C的结果在鲎试剂灵敏度复核范围内时,试验方为有效。
当E在0.5-2(包括0.5A和20及E在0.5E,-2E(包括0.5E,和2E)时,认为供试品在该浓度下无干扰作用。若供试品溶液在小于MD的稀释倍数下对试验有干扰,应将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释,再重复干扰试验。
可通过对供试品进行更大倍数的稀释或通过其他适宜的方法(如过滤、中和、透析或加热处理等)排除干扰。为确保所选择的处理方法能有效排除干扰且不会使内毒素失去活性,要使用预先添加了标准内毒素再经过处理的供试品溶液进行干扰试验。
3.凝胶限量试验按表2制备溶液A、B、C、D。使用稀释倍数为MVD并且已经排除干扰的供试品溶液来制备溶液A和B。
(四)结果判定
保温60分钟±2分钟后观察结果。
1.若阴性对照溶液D的平行管均为阴性,供试品阳性对照B的平行管均为阳性阳性对照溶液C的平行管均为阳性,试验有效。
2.若溶液A的两个平行管都为阴性,判供试品符合规定。
3.若溶液A的两个平行管均为阳性,判供试品不符合规定。
4.若溶液A的两个平行管中的一管为阳性,另一管为阴性,需进行复试。复试时溶液A需做4支平行管,若所有平行管均为阴性,定供试品细菌内毒素符合规定否则判定供试品细菌内毒素不符合规定。
(五)注意事项
1.试剂生物活性在pH6.0～8.0时酶活性稳定,pH≤3或≥10时,酶活性受到抑制,故试验时,供试品溶液pH应调节至6.0～8.0
2.试验操作过程应防止微生物的污染,水浴保温时应避免强烈震动。混合时应使用旋涡混合器,注意试管一定要垂直于插盘。试管溶液最好以不超过试管高度的1/3为宜。
