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细菌内毒素检验（二）

2021.5.17

4.3.3.2漩涡混合器

作用：混旋细菌内毒素

标准品，保证标准品溶液

的浓度一致。

方式：

对冻干粉的细菌内毒素标准品复溶后，应混旋15min。

标准品梯度稀释过程中，每步稀释应混旋30s.

4.3.3.3试管恒温仪：

作用：提供37℃恒温的环境。

方式：

对加入了内容物的鲎试剂分别放置于试管恒温仪中，37℃恒温60min±2min温育培养后，观察结果。

4.3.4试剂：

细菌内毒素标准品：工作标准品、国家标准品

鲎试剂：利用鲎血液中的变性细胞，经裂解液和机械方式促使细胞破裂而提取到的一种细胞溶解物，能与极微量的细菌内毒素形成特异凝胶反应，反应的速度和凝胶的坚固程度与内毒素浓度有关，是体外检测内毒素的敏感试剂。

细菌内毒素检查用水：含细菌内毒素的量极低：<0.015EU/ml ，不引入细菌内毒素，对内毒素试验无干扰作用。

4.3.5试验过程：

在进行日常检验前，需要进行鲎试剂灵敏度复核和供试品干扰试验，确定鲎试剂的标示灵敏度的准确性和供试品的最大有效稀释倍数、最小稀释倍数。

灵敏度复核试验：

每批鲎试剂用于检测前都必须进行灵敏度复核。

试验举例：内毒素工作标准品为100EU/支；

待测鲎试剂灵敏度λ＝0.25EU/ml。

1）制备内毒素标准溶液：取工作标准品一支，轻弹瓶壁使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈出划痕，用75％酒精擦拭后启开，加1mlBET水溶解，封口膜封住，置漩涡振荡器上混匀15min后进行稀释，步骤如下：

2）溶解鲎试剂：若鲎试剂为0.1ml装量，则取18支，每支加入0.1mlBET水溶解；若鲎试剂装量大于0.1ml，则取若干支，按标示量加入 BET水溶解，再取0.1ml分装于标准玻璃试管（10mm×75mm），将试管按如下形状排列。

3）加样：每列每支加入相应浓度的内毒素标准品溶液各0.1ml，第五列加入BET水0.1ml。

反应及结果判断：加样结束后用封口膜封口，轻振动混匀，置37 ℃水浴中保温60±2min，将每管拿出缓缓倒转180°，凝胶不变形为“＋”，凝胶不能保持完整为“－”。

当2.0λ四支管都为阳性，0.25λ四支管都为阴性时，试验成立，按下面底公式计算复核的灵敏度λc ：

λc＝lg-1(∑X/4)

（X:反应终点浓度的对数值。）

当0. 5λ≤λc ≤2.0λ时，鲎试剂灵敏度复核合格，检测时仍以标示灵敏度λ为准。

样品的干扰试验

注：当进行新药的内毒素检查试验前，或无内毒素检查项的品种建立内毒素检查法时，须进行干扰试验。（注：须三个批号以上的供试品，两个以上鲎试剂厂家的试剂）

当鲎试剂、供试品的处方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，须重新进行干扰试验。如：内毒素检查时，供试品阳性对照为阴性时。方法为通过比较鲎试剂与在水溶液中的内毒素和供试品溶液中的内毒素反应的差异程度，来确定供试品在该浓度下是否对内毒素检查有干扰。

操作：用内毒素检查用水和供试品将同一支内毒素标准品分别制备一系列浓度的内毒素溶液，详见下表：

编号	内毒素浓度/配制内毒素的溶剂	稀释用液	稀释倍数	所含内毒素的浓度	平行管数
A	无/供试品溶液	－	－	－	2
B	2λ/供试品溶液	供试品溶液	1	2λ	4
2	1λ	4
4	0.5λ	4
8	0.25λ	4
C	2λ/检查用水	检查用水	1	2λ	4
2	1λ	4
4	0.5λ	4
8	0.25λ	4
D	无/检查用水	－	－	－	2
A：供试品溶液 B：供试品阳性对照 C：阳性对照 D：阴性对照

结果判定：

当供试品阴性对照A和阴性对照D都为阴性，并且系列溶液C的结果在鲎试剂灵敏度范围内时，试验方为有效。

分别计算用检查用水制成的内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值（ES）和用供试品溶液和稀释液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的几何平均值（Et）；

ES =lg-1(ΣXS/4) Et =lg-1(ΣXt/4)

当ES在0.5λ～2λ(包括0.5λ和2λ)及Et在0.5ES～

2 ES（包括0.5 ES和2 ES）时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。

导致干扰的因素及解决方案：

导致干扰的因素：	排除干扰的方法：
pH值	稀释
抗凝因子	中和
螯合剂	过滤
葡聚糖	加热

4.3.5.3样品的细菌内毒素检验

细菌内毒素限值L的确定

药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）除药典有规定的，一般按以下公式确定： L＝K／M

K为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/(kg·h)表示，注射剂K= 5EU/(kg·h)，放射性药品注射剂K= 2.5EU/(kg·h)，鞘内用注射剂K= 0.2EU/(kg·h)；

M为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，以ml/(kg·h)、 mg/(kg·h)或U/(kg·h)表示，人均体重按60kg计算，人体表面积按1.62㎡计算。注射时间若不足1小时，按1小时计算。供试品每平方米体表面积剂量乘以0.027即可转换为每千克体重剂量（M）

按人用剂量计算限值时，如遇特殊情况，可根据生产和临床用药实际情况做必要调整，但需说明理由。

限值确认时要遵循从严原则，要考虑病人在疾病状态的耐受力和可能存在的联合用药的情况。

2）供试品最大有效稀释倍数的计算：

C·L

MVD＝

λ：测试用鲎试剂灵敏度标示值(EU/ml)。

L：供试品细菌内毒素限值。

C：供试品浓度或供试品复溶后所得样品浓度。

当L单位为EU/ml（溶液）时，C的单位为1ml/ml；

当L单位为EU/mg或者EU/u时（抗生素原料），C的单位为mg/ml或者u/ml。

3）供试品溶液稀释：将供试品稀释，稀释倍数为MVD。

含2λ内毒素标准品的供试品溶液（PPC）的制备：

4）加样：取鲎试剂8支，每支加入BET水0.1ml溶解。2支为样品管，加入样品液0.1ml；2支加入阴性对照管，加入BET水0.1ml；2支为阳性对照管，加入2 2λ浓度的内毒素标准品溶液0.1ml；2支为样品阳性管，加入0.1ml含2λ内毒素标准品的样品溶液。

37±1℃水浴中保温60±1min。

结果判断：

阳性对照为阳性

阴性对照为阴性试验结果成立

样品阳性对照为阳性

2支样品管均为阴性时，样品符合规定；

2支样品管均为阳性时，样品不符合规定；

样品管1支为阳性1支为阴性时，需复试。

复试时做4支样品管，有1支为阳性则样品不符合规定。

结果判断	样品管	阴性对照	阳性对照	样品阳性对照
符合规定	－－	－－	＋＋	＋＋
不符合规定	＋＋	－－	＋＋	＋＋
需复试	＋－	－－	＋＋	＋＋
复试符合规定	－－－－	－－	＋＋	＋＋
复试不符合规定	＋－－－	－－	＋＋	＋＋