LUX引物：实时PCR检测的多面手
【摘要】 通过使用单一荧光标记的LUX引物，实时PCR能够检测到每次循环中所产生的扩增子。当累积到足够的检测数据后，根据起始模板拷贝数直接与时间点成比例的特性，我们可以精确地推算出模板DNA的起始拷贝数。LUX（Light Upon eXtension）的作用原理是基于一个位于一段特异序列3’末端附近的荧光基团，而该特异序列能够提供荧光淬灭。在PCR实验中，我们发现随着LUX引物的延伸和双链产物的形成，被淬灭的荧光信号又会重新恢复。在本文中我们会提供一些LUX引物在不同仪器上应用的相关数据，例如ABI Prism 7700，Roche LightCycler，Corbett Rotor-Gene等。同时，我们也会提供一些使用FAM和JOE标记的LUX引物进行多重PCR检测的相关数据。
实时荧光定量PCR（qPCR）和RT-PCR（qRT-PCR）可以被用来检测不同生物来源（如组织和细胞抽提物）的DNA拷贝数和RNA转录本数[1,2]。qPCR通常都是使用荧光技术来检测DNA扩增产物。由于荧光信号的产生和检测与PCR扩增过程密切相关，因此就命名为“实时PCR”。在整个实验中，所有反应均在同一溶液中进行，而且不需要任何后处理过程。被测产物的数量与起始模板拷贝数直接相关，具体可以通过测量每次循环产生的荧光信号强度，并参照对照基因的标准曲线来定量。
已有的qPCR检测技术有好几种。某些双链DNA结合染料，如SYBR Green I，被应用于qPCR检测中，它们在与DNA结合后荧光信号会大大增强[3]。然而，这种检测方法无法应用于多重qPCR中，因为在多重qPCR中，一个试管中同时有好几个靶序列进行扩增。某些标记有荧光基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸探针也被应用于qPCR检测中[4,5]。这一类检测技术具有复杂的杂交和扩增动力学机制，而且相对来说成本也比较高。
Invitrogen公司现在推出了一种使用单一荧光标记引物的实时qPCR检测系统[6,7]。该引物具有自身荧光淬灭性能，但当它与靶序列配对后，其荧光就会恢复。整个设计原理是基于寡核苷酸的一级和二级结构对于所结合的荧光染料的荧光发射性能的影响。LUX Designer引物设计专属软件就是利用了这个设计原理，该软件是用于设计并定购靶基因或靶序列特异性的LUX荧光引物和相对应的未标记引物。该软件可以通过三种途径获得：下载并安装在电脑上；直接在网站上设计引物并定购或者是直接向Invitrogen公司询问。
材料和方法
质粒，模板和引物： 使用基因特异性引物对第一链cDNA进行PCR扩增，然后再用TOPO TA Cloning? Kit for
sequencing（Invitrogen, Cat. No.
K4595-01）克隆入pCR?4-TOPO载体，从而得到qPCR中用作模板的质粒。所制备的质粒浓度通过OD260来测定。为了便于把浓度转换为拷贝数，我们用9.1x1011拷贝数来代表1
mg/Kb质粒大小（包括插入片断）。
使用Micro-to-Midi Total RNA Purification System（Invitrogen, Cat. No. 12183-018）从人HeLa细胞和鼠NIH 3T3细胞中分离提取RNA。所得到的RNA产物再用DNase I（Invitrogen, Cat. No. 18068-015）进行消化，以除去基因组DNA的污染。
使用oligo-(dT)12-18 、六碱基随机引物、SuperScript? II First-Strand Synthesis System（Invitrogen, Cat. No. 11904-018），从总RNA反转录（20μl 反应体系）合成第一链cDNA。
实时PCR操作流程
ABI Prism 7700（Applied Biosystems）. 在50μl反应体系中，使用Platinum Quantitative
PCR SuperMix-UDG（Invitrogen, Cat. No. 11730-025）在ABI
Prism 7700上进行实时PCR。具体反应体系组成：
25μl SuperMix-UDG
1μl ROX对照染料（Invitrogen, Cat. No. 12223-012）
1μl FAM或JOE标记的LUX引物，10μM（终浓度是200 nM）
1μl 未标记的引物，10μM（终浓度是200 nM）
10μl模板
12μl无菌蒸馏水（Invitrogen, Cat. No. 15230-162）
PCR方案：
UDG处理：50℃，2 min.
变性：95℃，2 min.
循环（45次循环）：95℃ 15 sec.，55℃ 30 sec.，72℃ 30 sec.
为了建立PCR产物的熔解曲线，扩增反应结束后继续在40℃循环1分钟，然后升到95℃持续19分钟，最后再25℃保温2分钟。
LightCycle（Roche）. 在20μl反应体系中，使用Platinum Quantitative PCR SuperMix-UDG（Invitrogen, Cat. No. 11730-025）进行实时PCR。具体反应体系组成：
10μl SuperMix-UDG
1μl FAM标记的LUX引物，10μM（终浓度是500 nM）
1μl 未标记的引物，10μM（终浓度是500 nM）
1μl牛血清白蛋白，5 mg/ml（终浓度是250 ng/μl）
0.6 units Platinum Taq DNA polymerase（Invitrogen, Cat. No. 109660-18）（使反应体系中总含量达到1.2 units）
2μl模板
加无菌蒸馏水至20μl（Invitrogen, Cat. No. 15230-162）
PCR方案：
荧光：F1
程序选择：扩增
分析模式：定量
UDG处理：50℃，2 min.
变性：95℃，2 min.
循环（50次循环）：94℃ 5 sec.，55℃ 10 sec.，72℃ 10 sec.
熔解曲线分析：
程序选择：熔解曲线
分析模式：熔解曲线
95℃，0 sec.
55℃，15 sec.
95℃（以0.1℃/秒缓慢加热至95℃），0 sec.
40℃，0 sec.
Rotor-Gene RG-300（Corbett
Research）. 使用Platinum Quantitative PCR SuperMix-UDG（Invitrogen, Cat.
No. 11730-025）在Corbett
Rotor-Gene上进行实时PCR。对于36孔的转子采用25μl检测体系，72孔的转子则采用20μl检测体系。下面介绍的是用于72孔转子的20μl检测体系：
10μl SuperMix-UDG
1.6μl的LUX引物，2.5μM（终浓度是200 nM）
1.6μl 未标记的引物，2.5μM（终浓度是200 nM）
1μl模板
5.8μl无菌蒸馏水（Invitrogen, Cat. No. 15230-162）
PCR方案：
UDG处理：50℃，2 min.
变性：95℃，2 min.
循环（50次循环）：95℃ 5 sec.，60℃ 10 sec.，72℃ 15 sec.
为了建立PCR产物的熔解曲线，扩增反应结束后继续从45℃缓慢加热到95℃（每5秒升高1℃）
多重PCR. 在50μl反应体系中，使用Platinum Quantitative PCR SuperMix-UDG（Invitrogen,
Cat. No. 11730-025）在ABI Prism
7700上进行多重实时PCR。其中人SDHA基因（琥珀酸脱氢酶混合物，亚单位A，Acc. No.
NM_004168）采用FAM标记的LUX引物，鼠GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶，Acc. No.
NM_008084）采用JOE标记的LUX引物。具体反应体系组成：
25μl SuperMix-UDG
1μl ROX对照染料（Invitrogen, Cat. No. 12223-012）
1μl FAM标记的人SDHA LUX引物，10μM（终浓度是200 nM）
1μl 未标记的SDHA引物，10μM（终浓度是200 nM）
0.5μl JOE标记的鼠GAPDH LUX引物，10μM（终浓度是100 nM）
0.5μl 未标记的GAPDH引物，10μM（终浓度是100 nM）
10μl模板
加无菌蒸馏水至50μl（Invitrogen, Cat. No. 15230-162）
PCR方案：
UDG处理：50℃，2 min.
变性：95℃，2 min.
循环（50次循环）：95℃ 15 sec.，60℃ 30 sec.
为了建立PCR产物的熔解曲线，扩增反应结束后继续在40℃循环1分钟，然后升到95℃持续19分钟，最后再25℃保温2分钟。
结果和分析
LUX原理.
实时荧光定量PCR/RT-PCR技术已经具备了对DNA和RNA定量的精确性和可重复性。LUX荧光引物又为实时PCR提供了一个高效、低成本的检测平台。LUX引物是单一荧光标记的寡核苷酸，是针对某一靶基因特异性地定制合成的。LUX引物一般为20～30个碱基，内部形成发夹结构，其荧光基团靠近发夹结构的3’或5’末端，该发夹结构能提供荧光淬灭。LUX引物现有两种荧光标记：FAM标记（6-羧基-荧光素）和JOE标记（6-羧基-4’,5’-二氯-2’,7’-二甲氧基荧光素）。基于对荧光标记寡脱氧核苷酸杂交后荧光强度变化的一些初步研究，Invitrogen开始对影响染料与DNA结合后荧光强度变化的各种因素进行系统的研究[6,7]。我们仔细检测了一级结构对于内部标记寡核苷酸和5’,3’末端标记寡核苷酸荧光强度的影响。此外，我们也通过单链和双链寡核苷酸详细研究了二级结构对于荧光强度的影响。通过一系列的研究显示，荧光强度实际上取决于寡核苷酸的二级结构、荧光基团所处的序列框架以及荧光基团和寡核苷酸3’或5’末端的相邻距离。图１是两个序列相似的寡核苷酸的熔解曲线分析图，很明显当序列延长时，荧光强度发生了显著变化。
LUX引物在不同仪器上的使用 有许多仪器可以进行实时PCR检测，这些仪器主要可以分为三类：(1) 使用96孔固定板或384孔固定板和塑料管的仪器；(2) 使用离心机和塑料管的仪器；(3) 使用离心机和玻璃毛细管的仪器。这里我们选择ABI Prism 7700、Corbett Rotor-Gene 和Roche LightCycle 来各自代表这三类仪器。在实验中我们选用FAM和JOE作为荧光染料标记，其中FAM能被现在市场上所有的qPCR仪器有效检测到，而JOE也能被除LightCycle之外的大多数仪器有效检测到。图２、图３、图４是使用FAM-标记LUX引物在上述三类仪器上进行的实时PCR扩增图谱。
实时PCR的具体反应体系组成、体积以及PCR方案参见“材料和方法”。其中反应体系的体积会随着不同的仪器有所变化，但一般来说，玻璃毛细管可以采用20μl体系，塑料管则可以采用20～50μl体系。PCR循环次数取决于靶基因的拷贝数，但一般来说可以采用40～50次循环。本文中所有实验均采用了Invitrogen Quantitative PCR SuperMix-UDG，它具备了UDG酶防污染体系、基于抗体原理的Taq酶热启动性能和一个现成的高效、高敏感性的2x反应混合液。ROX对照染料是以独立包装形式免费提供的，但只有ABI Prism 7700需要用到它，而LightCycler 和Rotor-Gene并不需要对照染料校正。必须注意的是LightCycler 需要使用玻璃毛细管，这就需要在SuperMix-UDG中添加牛血清白蛋白(BSA，终浓度为250 ng/μl) 和加倍Platinum Taq DNA Polymerase的用量(在20μl测试体系中从0.6增加到1.2 units)。我们对几家生产厂商（Sigma、NEB、Idaho Technology）的BSA进行了测试，结果发现在PCR过程中效果相同。在所有测试的仪器上LUX引物都表现良好，而且从曲线的敏感性（较低的荧光域值循环数）、PCR效率（接近-3.32的斜率，表明具有接近100%的PCR效率）以及相关系数（接近1.00，表明具有非常好的实验重复性和精确性）可见，LUX引物的标准曲线也是高质量的。在对不同的仪器进行比较后我们发现，虽然LightCycler 在荧光染料的选择上更为局限一些，但就特异性和敏感性而言，这三类仪器都差不多。从这三类仪器的熔解曲线分析来看（没有提供具体数据），每个模板样品（LUX引物对的靶向扩增子）仅显示一个峰。基于开放式的转子设计和由此产生的快速的热交换能力，使得LightCycler 和Rotor-Gene 比起使用固定式加热块的ABI Prism 7700具有更快的运行时间。
多重实时PCR中的LUX引物 在多重实时PCR中，同一试管中含有不止一对基因特异性引物来用于扩增各自特异性的靶基因。由于需要在同一试管中测量不止一个PCR产品，所以需要采用不同的荧光染料来标记引物。目前LUX引物有FAM和JOE两种荧光染料标记可以用在多重反应中。图５是多重PCR中用LUX引物分别扩增不同浓度的模拟目的基因（人SDHA）和固定浓度的管家基因（鼠GAPDH）的典型结果。
相比普通PCR而言，多重PCR对实验的要求更高，因此需要对某些参数进行优化设计。在图5所述例子中，我们已经把内部对照基因GAPDH的引物浓度从200 nM 降低到了100 nM。其他的优化步骤还包括增加反应中MgCl2的浓度（从3 mM 增加到6 mM）和增加Taq聚合酶的用量。在这里添加所用的Taq聚合酶可以采用Platinum Taq DNA Polymerase stand-alone enzyme (Invitrogen, Cat. No. 10966-018)。有数据表明，LUX引物使得在不同仪器上进行的多重PCR反应更容易优化。我们采用相同的操作流程同样在Rotor-Gene（Corbett Research）上进行了多重PCR实验（没有提供具体数据）。考虑到将来对更广泛的染料光谱的需求，我们已经通过实验证明了虽然目前LUX引物只能提供两种荧光标记（FAM和JOE），但LUX原理同样适用于许多其他的染料，包括HEX和TET。
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