呕吐毒素检测酶联免疫操作流程
呕吐毒素检测仪酶联免疫操作流程：
呕吐毒素又称脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)，是单端孢菌素烯烃中的一种，其通常是由生长在谷类物品(如小麦、玉米、大麦和秣草)霉菌镰红菌素生成的。呕吐毒素DON广泛存在于全球，主要污染小麦、大麦、玉米等谷类作物，也污染粮食制品，人、动物在误食被呕吐毒素污染的粮食谷物后可能产生广泛的毒性效应。近年来发现，呕吐毒素DON可能与人类食管癌、IgA肾病有关，对人类、动物的健康均构成威胁。人畜摄入了被呕吐毒素DON污染的食物／饲料后，会出现厌食、呕吐、腹泻、发烧、站立不稳、反应变得迟钝等急性的中毒症状，严重时可损害造血系统造成死亡。研究表明，呕吐毒素DON可能对免疫系统有影响，有明显胚胎毒性和一定致畸作用，可能有遗传毒性，但无致癌、致突变作用。由于呕吐毒素DON的危害严重，引起了各国的普遍重视。谷物及饲料中呕吐毒素DON的含量有严格的限量标准。我国谷物、猪配合饲料、犊牛配合饲料、泌乳期动物配合饲料中呕吐毒素DON的限量标准为1.0mg／kg，牛配合饲料、家禽配合饲料中呕吐毒素DON的限量标准为5.0mg／kg。
4 需要的器材和试剂
4.1 仪器：CSY-E96D呕吐毒素检测仪、均质器 、振荡器、离心机、刻度移液管、天平（感量0.01g）
4.2 微量移液器：单道20µl-200µl，100µl-1000µl、多道300µl
5 样本前处理
5.1 样本处理前须知：
实验器具必须洁净并使用一次性吸头，以避免污染干扰实验结果。
5.2 配液：
配液1：复溶液
将2×复溶液用去离子水2倍稀释，用于样本的复溶，复溶液在4℃环境可保存一个月。
5.3 样本前处理步骤：
5.3.1 谷物（大米、玉米、小米等）及饲料处理方法
1）称取2g粉碎样品于50ml离心管中，加10ml去离子水，振荡5分钟，室温4000转/分离心10分钟；
2）取0.1ml上清，加入0.9ml复溶液，混匀；
3）取50μl进行分析。
样本稀释倍数：50 检测下限：150ppb
6 呕吐毒素检测仪酶联免疫试验步骤
将所需试剂从4℃冷藏环境中取出，置于室温平衡30min以上, 洗涤液冷藏时可能会有结晶需恢复到室温以充分溶解，每种液体试剂使用前均须摇匀。取出需要数量的微孔板及框架，将不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。
实验开始前，用去离子水将20×浓缩洗涤液按20倍稀释成工作洗涤液。
6.1 编 号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。
6.2 加样反应：加标准品应用液或样本50µl/孔到各自的微孔中，然后加抗体工作液50µl/孔，轻轻振荡5秒混匀，37℃避光反应30分钟。
6.3 洗 涤：将孔内液体甩干，用工作洗涤液250µl/孔充分洗涤5次，每次间隔30秒，最后用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）。
6.4 加酶反应：加酶标记物100µl/孔，37℃避光反应30分钟。
6.5 洗 涤：同上
6.6 显 色：加底物液A 50µl/孔，再加底物液B 50µl/孔，轻轻振荡5秒混匀，37℃避光显色15分钟。
6.7 终 止：加终止液50µl/孔，轻轻振荡混匀，终止反应。
6.8 测吸光值：用CSY-E96D呕吐毒素检测仪于450nm处测定每孔吸光度值（建议用双波长450/630nm）。测定应在终止反应后10分钟内完成。
7 结果分析
7.1 百分吸光率的计算
标准液或样本的百分吸光率等于标准液或样本的百分吸光度值的平均值（双孔）除以第一个标准液（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即
百分吸光度值（%）＝ | A | ×100% |
A0 |
A—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值
A0—0ppb标准溶液的平均吸光度值
7.2 标准曲线的绘制与计算
以标准液百分吸光率为纵坐标，对应的标准液浓度（ppb）的对数为横坐标，绘制标准液的半对数曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中待测物的实际浓度。
若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样本的准确、快速分析。（欢迎来电索取）
8 注意事项
8.1 室温低于25℃或试剂及样本没有回到室温（25℃）会导致所有标准的OD值偏低。
8.2 在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。
8.3 混合要均匀，洗板要彻底，在ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性。
8.4 在所有孵育过程中，用盖板膜封住微孔板，避免光线照射。
8.5 不要使用过了有效期的试剂盒，不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。
8.6 显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。0标准的吸光度值小于0.5个单位（A450nm< 0.5 ）时，表示试剂可能变质。
8.7 反应终止液有腐蚀性，避免接触皮肤。
9 贮藏及保存期
储藏条件：试剂盒于2-8℃保存，避免冷冻。
保 质 期：该产品有效期为1年，生产日期见包装盒。
