均相高通量方法在活细胞GPCR功能性和表面受体...（一）
均相高通量方法在活细胞GPCR功能性和表面受体结合试验中的研究
介绍：
G蛋白偶联受体（GPCR）是目前已知细胞表面受体家族中最大的一个分支，目前的药物筛选中有40%是针对GPCR进行的。先导化合物的筛选过程中，首先要针对这些潜在药物（化合物）进行疗效的评估（例如在心血管疾病及其它领域），如果想充分了解这些候选药物的作用机制，如受体和配体结合、受体聚集或者受体内化等，都需要进行大量的试验。因此，我们需要建立一个适合高通量筛选工作的高自动化及高灵敏度的试验方法。Tag-lite细胞筛选平台设计初衷即是为了提高细胞表面受体研究的灵活性。此平台可针对药理特性研究和研发治疗性抗体设计出各种各样不同的试验方案，非常适合进行大量初筛和复筛工作。这里我们展现出的结果是利用了Tag-lite受体配体结合试验平台及SpectraMax® Paradigm 微孔板读板机进行的GPCR激动剂和拮抗剂研究，其中包括了多巴胺D3、胰高血糖素GLP1和Mu阿片试验。衡量试验的关键性指标是Z值和窗口值，同时我们也给出了其针对cAMP、pERK和pAKT的试验结果。
方法：
TR-FRET检测的原理
HTRF技术（Homogeneous Time-Resolved Fluorescence）是基于TR-FRET技术（即结合了TRF和FRET两种技术）的基础上发展而来的。HTRF供体荧光染料分子采用了铕元素（Eu3+ cryptate）或Lumi4®-铽元素（Tb2+ cryptate）的穴状化合物，是与Lumiphore公司近期合作成果。很多种受体分子都能作为红色或者绿色荧光的发射体。当用两种荧光染料分子标记生物分子相互作用后，通过对穴状化合物标记的供体分子被激发后，其一部分能量由受体荧光染料分子所捕获。下图展示出了TR-FRET在使用Eu3+穴状化合物作为供体分子和XL665作为受体分子的标准试验流程和检测原理。
用户可升级高通量多功能读板机，双PMT 检测灵敏度高 兼容各种标准微孔板，最高支持1536孔板 Paradigm选配HTRF卡盒可用于pAKT，pERK和Tag-lite结合试验 EX 340nm，EM 616nm&665 384孔板检测时间：2.3min | 五功能检测模式可以满足各种不同应用 标准的紫外/可见吸收光检测模式 SoftMax® Pro软件将所有功能整合 pAKT，pERK，cAMP和Tag-lite结合试验的验证 EX 340nm，EM1 616nm，EM2 665 |
结果和讨论：
Tag-lite 活细胞GPCR结合试验
Tag-lite检测平台使用HTRF染料分子标记你感兴趣蛋白质的靶点。Cisbio公司生物检测系统可提供编码TAGs标签和感兴趣的蛋白序列的质粒，或者是已构建好质粒转染后的冻存细胞。当受体的配体（激动剂或拮抗剂）与受体结合后，构建表达标签的蛋白就可以被铽元素的穴状化合物所标记。Tag-lite检测技术是一个应用广泛的、理想的检测平台，可用于机制研究、受体二聚化、配体结合、第二信使检测等试验。
图一：Tag-lite细胞表面结合试验原理
cAMP检测试验
cAMP检测试剂盒采用HTRF技术，可以直接从悬浮细胞或者贴壁细胞中对cAMP含量进行检测。我们采用标记了铕元素（Eu3+ cryptate）的抗cAMP的单克隆抗体作为示踪分子，免疫竞争方法分析细胞内源性表达的cAMP和标记有d2荧光染料分子的cAMP标品，为了评价SpectraMax Paradigm 和 M5e多功能读板机在此类试验中的表现而做的滴度曲线，如下图所示。
图二： SpectraMax Paradigm 和SpectraMax M5e多功能读板机，针对cAMP浓度滴度曲线评价：W =21.4, Z’ = 0.91 . M5e: W = 15.5, Z’ = 0.97
HTRF细胞激酶试剂盒来检测pAKT和pERK含量
Cellul'erk为基于HTRF技术的检测试剂方法，可用于磷酸化AKT（Ser473）含量的检测，此试剂可直接在完整细胞中检测活化的ERK1/2和AKT。当受体被刺激后，引发了相关激酶的活化，通过该试剂盒就可检测到细胞裂解液中磷酸化蛋白的含量。磷酸化蛋白的测量应用了双抗体夹心法，两个抗体均为单克隆抗体。其中一个为抗磷酸化蛋白的抗体，标记Eu3+；另一个为抗蛋白其它位点的抗体，标记d2。
图三：刺激后和未刺激的细胞裂解液作为试验的内部质控条件，来检测获得结果的质量，窗口显示为高低两个质控
多巴胺D-3结合试验
多巴胺受体属于G蛋白偶联受体家族成员之一，主要分布于脊椎动物的中枢神经系统中，多巴胺受体与许多神经传导过程有关，包括兴奋、认知、记忆和小肌肉发育等，如果多巴胺受体信号传导异常能够引起神经系统障碍，因此多巴胺受体是常见测神经性药物的作用靶点。抗精神病药物是多巴胺受体的拮抗剂，而精神兴奋剂通常是多巴胺受体激动剂。多巴胺D3基于细胞Tag-lite结合试验，方便检测其激动剂和拮抗剂，开发全新的抗精神病药物。
图四：结合试验：HEK293细胞表达D3受体标记了Tb穴状化合物，然后受体与配体结合孵育90分钟，在两款仪器上分别设置不同的延迟和检测时间进行评估，检测时间越短会加大W和Z’值。
Delay – 20s; Int – 200s
Delay – 20s; Int – 500s
我们分别用SpectraMax Paradigm 和 SpectraMax M5e两款多功能读板机优化设置后，评估多巴胺D3 Tag-lite结合试验的表现，两歀仪器在竞争抑制试验的表现结果如下。Paradigm即得出了理想的结果也表选出了无与伦比的便利性，用户可以更具需要随时通过购买优化卡盒来升级系统满足未来的需要。
图五：竞争抑制试验，检测几个未知的多巴胺受体的激动剂和拮抗剂，并得出IC50s值。细胞孵育在6nM受体配体结合体系中以及一个受体激动剂PPHT和溴麦角环肽或拮抗剂NAPS,两款仪器得出相似的IC50s值。
优化SpectraMax Paradigm 和 SpectraMax M5e两款仪器的设置
通过修改延迟时间和检测时间来进行优化，我们发现当两台仪器都缩短了延迟时间和检测时间会获得更大的窗口值。
图六：使用SpectraMax Paradigm仪器设置不同检测时间和延迟时间会得出不同滴度曲线（左）和试验窗口值W（右），其优化设置为20us延迟时间，200us检测时间。
Mu 阿片受体结合试验：
μ-阿片受体与内啡肽有较高亲和力（μ=吗啡），μ受体激动剂是鸦片生物碱吗啡。通过受体激动剂来激活μ受体，例如吗啡镇能够镇痛，镇静，降血压，精神欢快和降低呼吸频率，长时间或者高剂量使用阿片能够导致机体耐受下降，如果阿片摄入过量会导致由于机体呼吸困难造成缺氧而死。如果过量摄入阿片可以使用阿片拮抗剂（如纳洛酮和纳曲酮）来抵消其作用。
这里我们给出了活细胞受体结合试验的结果，Mu-阿片受体使用Tb/红色受体（Tag-lite® Dynamic TR-FRET）方法标记，SpectraMax Paradigm多功能读板机来评价其与配体结合和与不同化合物反应的抑制常量。
图七：使用SpectraMax Paradigm多功能读板机系统在Mu-阿片配体结合和竞争抑制试验的结果（右），试验窗口和Z值分别是5.3X和0.89。
胰高血糖素 GLP-1结合试验：
GLP1受体被认为广泛表达于胰岛β细胞中，激活GLP1受体会刺激腺苷环化酶途径，最终导致胰岛素含量增加和释放，因此GLP1受体作为治疗糖尿病潜在靶点，GLP1受体也可以表达于大脑中，参与控制食欲，调节记忆力和学习力等。通过SpectraMax Paradigm多功能读板机系统来评价胰高血糖素GLP1受体配体结合和竞争抑制试验过程。
图八：SpectraMax Paradigm多功能读板机用于GLP1肽受体激动剂的试验检测结果，试验窗口值和Z值分别是19X和0.78。
结论：
SpectraMax Paradigm和M5e多功能读板机在几个Cisbio试验中均有出色的表现：cAMP检测，pERK和PAKT激酶试验和Tag-lite配体结合和竞争试验。
通过对两款仪器设置的优化，针对Tag-lite试验（使用384孔板），通过试验窗口和Z值对它们的表现进行了评价，结果非常好。
缩短SpectraMax Paradigm多功能读板机的延迟时间和检测时间，会得出更好结果。
SpectraMax Paradigm多功能读板机和Tag-lite技术结合，会成为一个强大的、具有高通量特点的，可研究细胞表面结合和功能性的平台。
