人骨髓不连续密度梯度离心用于间充质干细胞生产
人骨髓不连续密度梯度离心用于间充质干细胞生产
试剂和材料：
1. 完全培养基：α-MEM：α-低限量基础培养基，含谷氨酰胺，无核苷酸或脱氧核苷酸；添加：20%附加L-谷氨酰胺 2mmol/L、经FBS杂交瘤纯化，非热灭活、青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml。过滤除菌。储存于4℃，不超过2周；
2. 无钙或镁的磷酸盐缓冲液；
3. 无钙或镁的Hank′s平衡盐溶液；
4. Ficoll-Paque淋巴细胞分离液；
5. 聚丙烯离心管，15ml和50ml；
6. 塑料组织培养皿，直径15cm；
7. 塑料微量移液器枪头，10μl；
8. 0.85%台盼蓝盐溶液；
9. 微量离心管；
10. 带吊桶式转头的低温台式离心机
实验方法：
1. 去除抗凝管盖子，将骨髓液转移至50ml离心管中。加入室温的HBSS，确保体积达到25ml；
2. 取另一个50ml离心管，加入20ml Ficoll-Paque淋巴细胞分离液，将25ml细胞悬液轻轻加到Ficoll上层。HBSS与Ficoll间的界面不能被破坏；
3. 关闭闸，室温1800g离心30min；
4. 离心完毕，于Ficoll和HBSS的界面收集白色细胞层，将其移至新的50ml离心管中；
5. 用HBSS将收集到的细胞悬液体积调整至3倍，室温1000g离心10min。重复洗涤；
6. 用30ml预热至37℃的CMM重悬细胞；
7. 取10μl细胞悬液加到10μl台盼蓝中，血细胞计数器评价细胞的存活率，存活率需高于80%；
8. 将30ml细胞悬液移至直径15cm组织培养皿中，于5%CO2培养箱中培养至少15h；
9. 从培养箱中取出培养皿，吸出培养基；
10. 加入20ml预热的PBSA，润洗单层细胞，弃去；
11. 重复润洗过程3次；
12. 加入30ml预热的新鲜CMM；
13. 每隔一天重复此润洗和更新培养基操作，共6天；
14. 6天后，在倒置显微镜下观察单层细胞，贴壁的、成纤维细胞样MSCs克隆在培养皿中清晰可见。有时可能有造血细胞污染的迹象，但这些细胞可以在传代时被去除。培养物达到50%—60%汇合时，可以进行MSCs培养物的扩增和冻存；
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