骨髓间充质干细胞原代分离
实验概要
本实验用两种方法(贴壁培养方法和密度梯度离心法)进行了骨髓间充质干细胞原代分离。
主要试剂
所用试剂盒
小鼠骨髓间充质干细胞分离和培养试剂盒 货号：MBMS-000-001
大鼠骨髓间充质干细胞分离和培养试剂盒 货号：RBMS-000-001
猪骨髓间充质干细胞分离和培养试剂盒 货号：PBMS-000-001
人骨髓间充质干细胞分离和培养试剂盒 货号：HBMS-000-001
规格：5次
产品名称 | 货号 | 规格 | 数量 |
（小鼠、大鼠、猪、人）骨髓间充质干细胞完全培养基 | 200ml/瓶 | 1瓶 | |
PBS | BM-001-500 | 500ml/瓶 | 1瓶 |
双抗 | BS-003-100 | 100ml/瓶 | 1瓶 |
成纤维培养基 | 200ml/瓶 | 1瓶 | |
0.25%胰酶 | ET-002-100 | 100ml/瓶 | 1瓶 |
实验步骤
1. 贴壁培养方法
1) 用消毒针头在膝关节上穿一小孔。
2) 用吸有成纤维细胞培养液的注射器（7号针头）冲出骨髓，过4号半针头制成单细胞悬液。
3) 将所得细胞悬液移入15 mL离心管中, 1 000 r/min, 10 min离心, 弃掉上清液。
4) 调整细胞密度, 以1×106 个/mL的密度接种于培养瓶中, 标记为原代细胞( P0)。
5) 置37℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中静置培养。
6) 于72 h后首次更换培养液, 去除未黏附细胞,以后每3天更换1次培养液。
7) 待细胞长至80%～90%融合时传代。
2. 密度梯度离心法
1) 用消毒针头在膝关节上穿一小孔。
2) 用吸有培养液的注射器（7号针头）冲出骨髓。
3) 用成纤维细胞培养液适当稀释,离心去脂肪层。
4) 加入5ml成纤维细胞培养液,制成细胞悬液。
5) 用比重1.073的Percoll分离液分离，400g离心20min。
6) 可见中间有一层约1-2mm厚的白色层，仔细用吸管吸取界面。
7) 加入PBS 3ml 离心洗涤。
8) 调整细胞密度, 以1 ×106 个/mL的密度接种于培养瓶中, 标记为原代细胞( P0)。
9) 置37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中静置培养。
10) 刚接种的细胞镜下呈大小较均一的圆形，胞膜清晰，胞体透亮。
11) 接种24h 后可见细胞贴壁。未贴壁的细胞及粘附于贴壁细胞之上的杂细胞在换液的过程中逐渐被清除。
12) 一般5天左右后传代。
注意事项
1. 贴壁培养方法注意事项
1) 注意原材料的新鲜与保鲜。一般取来的材料都是当天来做，而且取材时最好是放在含有双抗的PBS里，用冰盒运输。
2) 取材时要保持严格的无菌操作。
3) 将组织漂洗干净，不要残留血块和毛发。
4) 取材时要选用锋利的手术器械，防止损伤组织。
5) 消化时间要掌握好，控制在大的组织块刚刚完全消化完。
6) 要标记好细胞的品系，周龄，雌雄等信息。
7) 注意要用胶原酶I，而且消化时要加入DNA酶，防止粘稠。
2. 密度梯度离心法注意事项
1) 注意原材料的新鲜与保鲜。一般取来的材料都是当天来做，而且取材时最好是放在含有双抗的PBS里，用冰盒里运输。
2) 取材时要保持严格的无菌操作。
3) 24h后及时换液。
4) 培养液非常重要，影响分离效果。
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项目成果
