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人源抗体开发——B细胞永生化（一）

2021.6.29

人源单克隆抗体具有免疫原性低、半衰期长等优势，成为了体内应用中不可或缺的生物制剂。人类抗体库为人源单克隆抗体的制备提供了丰富的来源，人B细胞永生化是获得人类抗体库的潜在有效方法，可应用于人源单克隆抗体的制备。由于各平台均有亟待解决的问题，基于人B细胞永生化的抗体制备尚局限在实验室研究阶段，本文以明确现有的人B细胞永生化抗体制备平台的优劣及其可行性分析，以期为人源单克隆抗体制备技术的进一步发展提供参考。

人源单克隆抗体(Human monoclonal antibody，HuMAb) 是指完全由人类基因编码表达的单克隆抗体，已经成为未来抗体发展的主要方向。HuMAb具有更丰富的表位、更低的免疫原性、更长的半衰期、更佳的生物活性，在体内应用中表现良好，如体内诊断、传染病预防、抗体疗法和疾病预后判断等。HuMAb制备过程中还可发掘出高效或/和广泛交叉反应的“超级抗体”，其具有治疗和预防多种病毒感染及其所致疾病的潜力，包括抗原性高度可变的病毒和新兴的或具有大流行潜力的病毒。自SARS-CoV-2引起的新冠肺炎(COVID-19) 疫情爆发以来，全球面临着巨大的公共卫生安全威胁，诊断试剂、抗病毒药物和疫苗的研发迫在眉睫，HuMAb制备技术可以为高效建立新型病毒疫情快速响应平台提供有力的支持。

1 HuMAb 制备技术

目前，HuMAb的制备主要基于四种技术，分别是转基因动物、抗体库展示、单细胞克隆和B细胞永生化 (表1)，各技术可独立进行或者联合使用。

通过转基因动物和抗体库展示技术制备HuMAb已有诸多临床转化的成功实例，但这类抗体不能称之为真正的全人源抗体。小鼠的免疫系统和人类存在很大差异，抗体的亲和成熟、型别转换与人类有差异，无法代表天然人源抗体库。抗体库展示技术利用DNA重组技术将抗体信息展示于特定载体上，由于抗体片段是由分别克隆的免疫球蛋白重链和轻链可变区的随机配对产生的，因此也不能真实反映生理抗体信息。

直接从人B细胞中获得目的抗体是一种高效快捷的方法，因为前期无需抗原制备和免疫过程，且天然的抗体库比随机配对的抗体文库具有更高的敏感性和特异性，从受感染者中制备的HuMAb可以提供有关人抗体表位的信息，这些表位对于疫苗的开发以及潜在的治疗应用至关重要。虽然抗体库展示、单细胞克隆和B细胞永生化技术均可利用人B细胞获得HuMAb，但三者差异明显。抗体库展示技术的主要局限如前所述，单B细胞克隆需要先进行繁琐的抗体异源重组表达后才可进行鉴定筛选，B细胞永生化可先进行功能鉴定，直接对抗原特异性阳性的细胞池进行克隆化，与前者相比目的性更强、工作量小、筛选周期更短。

综上，与传统方式相比，人B细胞产生的天然抗体经过人类免疫系统选择，是HuMAb的最佳来源，而B 细胞永生化则是获得HuMAb的潜在有效方法。通过B 细胞永生化技术获得的单克隆抗体在生产制备和应用方面具有以下优势：

1)筛选周期短，可实现抗体的快速筛选；

2) 具有更低的免疫原性，体内应用良好；

3) 可以获得更多高亲和力抗体；

4) 可以从受感染者中获得针对未知抗原的抗体，应对突发疫情。

2 人B 细胞永生化方法

离体培养B细胞使其有效增殖和活化是获得天然人源抗体最直接的方式，然而由于B细胞的数量少、分泌抗体量不足以及体外培养存活时间短、仅能进行有限增殖等问题，限制了下游鉴定和分离操作的进行。目前，B细胞永生化方法主要有人类B细胞杂交瘤技术、EBV转化、慢病毒介导的遗传修饰以及CD40L联合多种细胞因子的体外诱导培养等(图1)，各方法可单独或并行使用。

2.1 制备人-鼠/人-人杂交瘤细胞

将B细胞与骨髓瘤细胞融合是获得分泌抗体的永生化B细胞最常用的方法。早期通过利用人B细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合获得人-鼠异源性杂交瘤细胞，但因建立细胞株困难而产量低，且在传代过程中很可能丢失某些人类染色体，存在不稳定性。研究者们广泛探索了可替代的融合伴侣细胞，这些融合伴侣细胞主要有鼠-人嵌合型骨髓瘤细胞系、人骨髓瘤细胞、人骨髓瘤细胞衍生细胞系和人淋巴母样细胞系。但是用这类融合伴侣细胞产生的人-人杂交瘤细胞不能有效兼顾产量和稳定性需求，且杂交瘤产生的免疫球蛋白的类型受亲代细胞特性的强烈影响，因此获得的杂交瘤分泌的抗体类型单一。影响融合效率的另一个重要因素是融合方法，传统的PEG融合法操作简单、成本低，但是效率低下；电融合是最适合产生杂交瘤的方式，但是电融合易导至大量的细胞死亡。

目前人类杂交瘤技术的相关方法存在着融合效率低、亚克隆易丢失、工作量大、抗体产量低等缺陷，应用于人类抗体的产生极为困难，无法成为挖掘人类抗体库的首选方法。

2.2 病毒感染维持增殖细胞中端粒稳态

端粒是保持染色体的完整性和控制细胞分裂周期的重要结构，端粒维持机制可以抵消DNA复制过程中端粒缩短以及由此引发的DNA损伤反应、细胞周期停滞和凋亡，EBV基于端粒维持机制的激活而使宿主细胞永生化。在EBV诱导B细胞永生化的早期和晚期，端粒酶依赖和非依赖的端粒维持通路在感染细胞中都被激活。利用EBV转化的方法，研究者已成功获得了鉴定识别HIV、H1N1流感病毒、H5N1流感病毒、RSV、SARS-CoV和DENV的人类中和单抗。此外，有研究报道在未发生淋巴瘤的HBV慢性感染患者的PBMC中建立了具有无限增殖潜力的B细胞，另有研究发现SV40可有效感染人B细胞并明显延长其体外存活时间(观察至100天)，这些则提示了SV40、HBV感染可能成为转化B细胞永生化的潜在方法。

病毒一般仅感染特定的宿主细胞，使用EBV介导的B细胞永生化效率低，需要筛选大量的B细胞以获得具有所需特异性的非常罕见的B细胞克隆，且B细胞的长期生长和永生化可能与染色体畸变有关，细胞在基因突变过程中往往伴随细胞表型的改变，如发生肿瘤细胞转化、细胞生长停滞，抑或是传代过程中表现出染色体的不稳定性，这均导至难以进行B细胞单克隆化筛选。不仅如此，用于生成体内应用抗体的细胞不能含EBV和其他人类病毒，基于病毒转化的人类抗体的分离纯化难度更高。

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