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胰蛋白酶(trypsin）纯化

2020.9.07

［原理］
胰蛋白酶与另外两种蛋白水解酶：糜蛋白酶（胰凝乳蛋白酶）和弹性蛋白酶同时存在于胰脏中。由于胰蛋白酶、糜蛋白酶和弹性蛋白酶的酶蛋白分子在结构上及其它很多性质上的相似之处，往往在一般的制备过程中很难将它们彼此彻底分开，传统的分离、纯化技术难以达到十分满意的结果，但采用亲和层析技术，大大提高了分离纯化的效果。
鸡卵类粘蛋白是一种专一性很强的胰蛋白酶的抑制剂，对猪和牛的胰蛋白酶有很强的抑制作用（而对胰凝乳蛋白酶无抑制作用）。在pH7.6～8.0的范围内，猪或牛胰蛋白酶能牢固地吸附在鸡卵类粘蛋白上，在 pH2.5～3.0的范围内，能从鸡卵类粘蛋白上被洗脱下来。因此，采用鸡卵类粘蛋白作为配基制成亲和吸附剂，可以从胰蛋白酶粗品直接获得高纯度的胰蛋白酶。反应的基本原理如下：
胰蛋白酶亲和层析流程示意图
亲和层析需要选择耐用的，非特异性吸附少的，水不溶性的载体，此载体并可在温和条件下与配基能共价偶联，而又不影响配基原有的生物学特性。琼脂糖凝胶颗粒，具有机械强度高、通透性好、非特异性吸附少等优点，目前作为亲和层析载体使用最广泛。
琼脂糖作为亲和层析基质使用最广泛。为了增加琼脂糖的稳定性和提高机械强度，在碱性条件下加入环氧氯丙烷进行交联，并适当加入一些硼氢化钠，以还原除去琼脂糖中某些不利于层析的离子基团（如硫酸基）。珠状交联琼脂糖，在接上配基之前，需要活化。活化方法很多，溴化氰活化最常用，但该化合物极毒。

本实验方法一使用染料 “对β-硫酸酯乙砜基苯胺（SESA）”与琼脂糖反应生成ABSE-琼脂糖，经重氮化反应后与卵粘蛋白配基偶联，制得胰蛋白酶的亲和吸附剂。亲和吸附剂制备过程主要反应如下：
实验中方法二采用用环氧氯丙烷活化，再与卵粘蛋白配基偶联的方式。最后制备亲和层析柱纯化胰蛋白酶。
本实验采用自制珠状交联琼脂糖经活化、偶联制备亲和吸附剂。
［试剂和器材］
１、试剂
（1）琼脂糖
（2）卵粘蛋白
（3）环氧氯丙烷
（4）碳酸钠
（5）对β-硫酸酯乙砜基苯胺
（6）0.1mol/ＬpH 9.5 碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液
（7）0.1mol/ＬpH7.5 Tris-HCl缓冲液
（8）0.2mol/ＬpH2.5 甘氨酸缓冲液
（9）1mol/ＬNaOH 溶液
（10）1mol/ＬNaOH 溶液（含2mg/mL NaBH4）
（11）1mol/ＬHCl 溶液
（12）1.5mol/Ｌ碳酸钠溶液
（13）5%（质量分数）NaNO2溶液
（14）1，4-二氧六环

2、器材
（1）沸水浴、恒温水浴
（2）加热搅拌器
（3）离心机
（4）层析柱 1.2cm×30cm
（5）烧杯、试管、布氏漏斗、抽滤瓶、三角烧瓶
（6）金属网筛、温度计、pH试纸

[方法和步骤]
一、亲和吸附剂——固相化鸡卵粘蛋白的制备
方法一
1、交联琼脂糖
取 100mL烧杯，称取琼脂糖2g，加入蒸馏水30mL，用沸水浴使之溶解，冷却凝固。将凝固的琼脂糖用20目筛网制成小颗粒。
在小烧杯中称取凝胶颗粒，以小颗粒湿重量每g加入1mL 1mol/L NaOH(其内含2 ml/mL NaBH4)的比例，将相应量的NaOH 溶液加入盛有琼脂糖颗粒的小烧杯中。小烧杯放入盛有适量水的250mL烧杯中，以水浴方式在加热搅拌器上加热至30℃，搅拌。按上面所加 1mol/L NaOH(其内含2 ml/mL NaBH4)量的1/10比例，量取环氧氯丙烷，并分成三份。在30℃加热搅拌的琼脂糖颗粒中加入第一份环氧氯丙烷后，缓缓搅拌升温至45℃，加入第二份环氧氯丙烷，再缓缓搅拌升温至60℃时，加入第三份环氧氯丙烷。保持60℃，搅拌反应2h。趁热抽滤，用近沸的蒸馏水抽滤洗涤凝胶颗粒至中性。
2、对氨基苯磺酰乙基（ABSE）-琼脂糖
取100mL烧杯，称取上面交联琼脂糖（抽干湿重）10g，加入10mL蒸馏水，用1 mol/L NaOH调pH13（试纸测定）。
取10mL试管，称入0.8g对 β-硫酸酯乙砜基苯胺（SESA），加入5mL蒸馏水，置旋涡震荡器上震荡5min，用1.5 mol/L Na2CO3调整溶液pH至6，3 000r/min离心15min。离心上清液倒入盛有交联琼脂糖的烧杯中，按上述水浴方式，置加热搅拌器上60℃水浴搅拌3min 后，加入0.25g Na2CO3， 60℃搅拌反应45min。抽滤，沉淀用 0.05 mol/L NaOH洗涤三次，用蒸馏水洗涤三次，抽干。

纯化胰蛋白酶

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