亲和层析法(affinity chromatography)纯化胰蛋白酶-2
本实验采用猪胰蛋白酶的天然抑制剂—鸡卵类粘蛋白作为配基．从猪胰脏的粗提液中分离纯化胰蛋白酶。鸡卵类粘蛋白是一种专一性很强的胰蛋白酶的抑制剂，对猪和牛的胶蛋白酶有很强的抑制作用。而对胰凝乳蛋白酶无抑制作用。在pH7.6~8.0的范围内，猪或牛胰蛋白酶能牢固地吸附在鸡卵类粘蛋白上，在
PH2.5~3.0的范围内，能从鸡卵类粘蛋白上被洗脱下来。因此，采用鸡卵类粘蛋白作为配基合成亲和吸附剂，可以从猪胰脏的粗提液中，通过亲和层析直接获得纯度很高的猪胰蛋白酶。比活力可以达1.5~2.0×104BAEE
单位／mg 酶蛋白，相当5次重结晶的胰蛋白酶，纯化效率可提高10－20倍以上。
三、仪器、原料和试剂
器材：
紫外分光光度计、核酸蛋白质检测仪、高速组织捣碎机、恒温水浴摇床、L 层析柱(10mm×100mm)、G—3玻璃烧结漏斗、酸度计、抽滤瓶。
原料
新鲜猪胰脏
试剂
1. 环氧氯丙烷，1，4—二氧六环，乙烯，乙腈，溴化氰
2. 5mol/L 硫酸；
3. 5.0mol/L 氢氯化钠
4. 0.2mol/LpH9.5碳酸钠缓冲液。
5. 亲和柱平衡液：0.5mol/L 氯化钾—0.05mol/L 氯化钙－0.1mol/L，pH7.8 tris-HCl 缓冲液；
6. 亲和柱洗脱液：0.1mol/L 甲酸—0.5mol/L 氯化钾，pH2.5混合液；
7. pH2.5~3.0乙酸酸化水。
8. Sepharose 4B ，鸡卵类枯蛋白，纯胰蛋白酶。
四、操作步骤
(一) 载体—SePharose4B 的活化
1．环氧氯丙烷活化法：
取适量的sepharose 4B，于G—3玻璃烧结漏斗(简称G—3漏斗)上抽去保护液。称10g(湿重)Sepharose
4B，用100mL0.5mol/L 氯化钠溶液淋洗，除去56Pha rose 4S 凝胶内的保护剂，用蒸馏水洗净，转移到100mL
的锥形瓶内。然后加入6.5mL 2.0moL／L 氢氧比钠溶液、1.5mL 环氧氯丙烷、15mL
56％1，4二氧六环，于45℃的恒温水浴摇床内振荡活化2小时。然后将活化的凝胶转移到G3漏斗内抽干，用蒸馏水洗至pH8.0左右，再用20mL
0.1mol/L，pH9.5碳酸钠缓冲液淋洗。处理完毕后立即偶联。
2．溴化氰活化法：
称取10g Sepharose 4B(湿重)，凝胶处理方法与1相同，把SePharose 4B 凝胶转移到一个100mL
的烧杯中(以下操作步骤必须在通风橱内进行)。加入15mL
0.2mol/LpH10.0的碳酸钠缓冲液，然后将烧杯放置冰浴中，用电磁搅拌器慢慢搅拌。戴上胶皮手套，小心称取3g 溴化氰，加入3mL
乙腈将溴化氰溶解。
取一支滴管向烧杯内滴加溴化氰使它与Sepharose 4B 反应，同时取另一支滴管向烧杯内滴加6mol/L 的氢氧化钠．使反应体系的pH
值保持在pH10.0左右(在酸度计上校正)，待溴化氰加完以后继续搅拌，反应5分钟。此时反应体系的pH
值不再下降，仍维持在pH10.0左右，停止反应。迅速转移到G3漏斗内抽滤，抽滤瓶内应预先加入一定量的固体硫酸亚铁，以破坏滤液中未反应的溴化氰。用
200mL 预冷的蒸馏水淋洗，最后浸泡在20mL 0.1mol/LpH9.5，碳酸钠缓冲液中，处理完成后立即偶联。
3．配基—鸡卵类粘蛋白的偶联：
将已经活化处理好的Sepharose 4B 转移到一个50mL 的锥形瓶内。然后取I0mL0.1mol/L，pH
9.5的碳酸钠缓冲液将约150mg 的鸡卵类粘蛋白溶解，取出0.1mL
蛋白溶液稀释30倍，在紫外分光光度仪上测定A280。根据消光系数A＝4.13计算出偶联前的蛋白含量。再将9.9mL
蛋白溶液加入到盛有活化Sepharose 4B 的三角瓶内，混匀，在40－45℃的恒温水浴摇床内振荡偶联20－24小时左右，终止偶联。
将凝胶转移到G3漏斗内，用100mL 0.5mol/L
的氯化钠溶液抽浊、淋洗，以除去未被偶联的鸡卵类粘蛋白。取一个干净的抽滤瓶收集滤波，测定滤液A280，计算出末被偶联蛋白的量，然后用100mL的蒸馏水洗，用50mL
0.1mol/L 甲酸－0.5mol/L
氯化钾，pH2.5甲酸混合液洗，最后用蒸馏水洗至约pH6.5即可。将凝胶转移至50mL小烧杯内，用30mL
0.5mol/L氯化钾—0.05mol/L氯化钙0.1mol/L、pH7.8Tris—HCL 缓冲液浸泡20分钟。脱气后装柱或置4℃冰箱保存。
(二) 胰蛋白酶粗操液的制备
取50g
猪新鲜胰脏(除去脂肪和结缔组织)剪碎置于高速组织捣碎机内，加入200mL预冷的pH2.5~3.0的乙酸酸化水，匀浆。于10℃提取4小时以上，4层纱布过滤，收集滤液并用5mol/L
的氢氧化钠调至PH8.0，加入终浓度为0.1mol/L 氯化钙及1~2mg
胰蛋白酶晶种，置4℃激活12~16小时或在室温(25℃左右)激活2~4小时。待胰蛋白酪比活达到1000~1500 BAEE 单位／mg
以后，用6mol/L 硫酸调至pH3.0停止激活。
放置4℃冰箱内备用。测定胰蛋白酶活性。
(三)亲和层析纯化胰蛋白酶
取一支层析柱(10mm×100mm)，装入少量亲和柱平衡液(0.5mol/L 氯化钾—0.05mol/L 氯化钙0.1mol/L，pH7.8
Tris—HCl
缓冲液)，将亲和吸附剂一次装入柱内，待亲和吸附剂自然沉降至约1/2总体积后，调节合适的流速。用亲和柱平衡液平衡。用核酸蛋白质检测仪检测流出液．待基线达到稳定后即可。
取一定体积的蛋白酶粗提液(30－50mL，视酶液的蛋白浓度及比活而定)调至pH8.0．用滤纸过滤，取滤液上柱吸附，然后用亲和柱平衡液平衡。用核酸蛋白质检测仪检测流出液，待基线达到稳定后改用亲和柱洗脱液(0.1mol/L
甲酸—0.5mol/L 氯化钾，pH2.5混合液)洗脱。收集洗脱峰2，测定酶蛋白含量及活性，
层析图谱，如图3—9。
图3—9 亲和层析纯化胰蛋白酶洗脱曲线
平衡液：0.5mol/L 氯化钾，0.05mol/L 氯化钙，0.1mol/L，pH7.8Tris-HCl 缓冲液。
洗脱液：0.1mol/L 甲酸，0.5mol/L 氯化钾，pH2.5混合液。
(四) 胰蛋白酶的保存
经亲和层析分离得到的胰蛋白酶，一般是比较纯的酶，但是酶蛋白的浓度往往很低。通常可用pH5.0的乙酸透析除去溶液中的无机盐，然后冰冻干燥成粉末，长期保存。也可将酶溶液放在－20℃的冰箱冰冻保存或者在4℃，pH3.0的酸性溶液中保存，可保存两年左右。
(五)结果处理
