聚丙烯酰胺凝胶电泳操作步骤
样品制备
样品可以是任何包含蛋白质或核酸的材料。
如果需要,可以将分析样品与化学变性剂混合,通常将SDS用于蛋白质,将尿素用于核酸。
SDS是一种阴离子去污剂,可使二级和非二硫键连接的三级结构变性,并根据其质量成比例地对每种蛋白质施加负电荷。尿素打断核酸碱基对之间的氢键,使组成链退火。将样品加热到至少60°C会进一步促进变性。
可以将跟踪染料添加到溶液中。它通常具有比分析物更高的电泳迁移率,以允许实验人员在电泳过程中跟踪溶液通过凝胶的过程。
聚丙烯酰胺凝胶的制备
凝胶通常由丙烯酰胺,双丙烯酰胺,可选的变性剂(SDS或尿素)和pH值已调整的缓冲液组成。
出于特殊目的,可以改变双丙烯酰胺与丙烯酰胺的比例,但通常为35的约1份。凝胶的丙烯酰胺浓度也可以改变,通常在5%至25%的范围内。
较低百分比的凝胶更适合解析分子量非常高的分子,而解析较小的蛋白质则需要更高百分比的丙烯酰胺,
凝胶通常在凝胶浇铸机中的两个玻璃板之间聚合,并在顶部插入梳子以形成样品孔。
凝胶聚合后,可以将梳子移开,并准备进行电泳。
电泳法
PAGE中使用各种缓冲液系统,具体取决于样品的性质和实验目的。
用于阳极和阴极的缓冲剂可以相同或不同。
在凝胶上施加电场,使带负电荷的蛋白质或核酸从负离子向正电极(阳极)穿过凝胶迁移。
根据它们的大小,每个生物分子在凝胶基质中的移动方式不同:小分子更容易穿过凝胶中的孔,而大分子则更困难。
凝胶通常运行几个小时,尽管这取决于施加在凝胶上的电压。
在设定的时间后,生物分子将根据其大小迁移不同的距离。
较小的生物分子沿凝胶向下移动的距离较大,而较大的生物分子则保持更靠近起点。
因此,可以根据大小大致分离生物分子,其大小主要取决于变性条件下的分子量,但也取决于天然条件下的高阶构象。
侦测
电泳后,可对凝胶进行染色(对于蛋白质,最常见的是考马斯亮蓝或放射自显影;对于核酸,溴化乙锭;对于银染,则可以),以使分离的蛋白质可视化,或者进行进一步处理(例如Western blot) )。
染色后,不同种类的生物分子在凝胶中显示为不同的条带。
通常通过在凝胶中的另一条泳道中运行已知分子量的分子量大小标记物来校准凝胶并通过比较相对于标记物的移动距离来确定未知生物分子的近似分子量。
