磷酸钙法转染HEK293T细胞
磷酸钙法
| 实验方法原理 | 常规转染技术可分为两大类，一类是瞬时转染，一类是稳定转染（永久转染）。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其它调控元件的分析。一般来说，超螺旋质粒DNA转染效率较高，在转染后24-72小时内（依赖于各种不同的构建）分析结果，常常用到一些报告系统。 |
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| 实验材料 | 293T细胞 |
| 试剂、试剂盒 | 无菌水ddw NaCl KCl Na2HPO4 glucose HEPES CaCl2 |
| 仪器、耗材 | Eppendorf管 培养皿 培养箱 |
| 实验步骤 |
1. 铺细胞： 选择状态良好的293T细胞传代， 2-3x105个细胞/35mm dish。 2. 20-24h后，待细胞长至铺满瓶底约50-70%的时候，进行转染。下面就35mm dish为例，采用以下转染体系： ddw： 105ul plasmid： 2ug （如0.5ug/ul， 即用4ul） 2M CaCl2： 16.5ul 2XHBS： 125ul 按上述顺序，往eppendorf管中依次加入上述四种试剂。 先将前三者混匀， 最后加2XHBS。 一种方法是，加2XHBS时要逐滴加入， 吹打至微现乳白色， 立即均匀滴入培养皿，轻轻摇匀后置于培养箱中，6-8h后换液。 另一种方法是， 加入2XHBS后立即吹打约40下（不过这个要根据每个人的力道和吹打的频率而定， 建议做一个梯度实验，吹打不同的次数看哪次的转染效率高以后就按这个次数来吹打）， 之后步骤同上， 立即均匀滴入培养皿，轻轻摇匀后置于培养箱中，6-8h后换液。
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| 注意事项 |
1.HBSP 缓冲液的 pH 值在 6 .70 和 7 .10 时转染HEK 293T 细胞的效果不好 ,细胞成活率低， 有大颗粒状物体存在;pH 值在 6 .96 时转染效果好，细胞存活率高， 蓝染细胞明显。 2.未纯化的 lacZ-pShuttle 质粒转染 HEK 293T 细胞转染效率低， 细胞成活率很低，而纯化后的质粒转染效率高 ,蓝染细胞明显 。
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| 其他 |
1.转染后培养 6h 进行甘油休克效果最佳，比培养 0h 直接进行休克转染效率升高584.4 %。 2.甘油休克时间为4.5min 时转染效果最佳，比不用甘油休克转染效率升高 130.8 %。 3.来源于论文《一种用磷酸钙法高效转染 HEK 293T 细胞方法的建立》,陈晓,蒋捍东,路新枝,于文功。 展开 |
