间充质干细胞的传代培养
间充质干细胞的传代培养
试剂和材料：
1. 完全培养基：α-MEM：α-低限量基础培养基，含谷氨酰胺，无核苷酸或脱氧核苷酸；添加：20%附加L-谷氨酰胺 2mmol/L、经FBS杂交瘤纯化，非热灭活、青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml。过滤除菌。储存于4℃，不超过2周；
2. PBSA；
3. 胰蛋白酶/EDTA；
4. 聚丙烯离心管，15ml和50ml；
5. 塑料组织培养皿，直径15cm；
6. 塑料微量移液器枪头，10—1000μl；
7. 0.85%台盼蓝盐溶液；
8. 微量移液器；
9. 改良的Neubauer血细胞计数器
实验方法：
1. 在培养的MSCs细胞中小的、贴壁、纺锤形的成纤维细胞样细胞汇合至60%时，对其进行处理。如果单层细胞稀疏，则进行继续润洗和更换培养基；
2. 按如下步骤消化单层细胞；
（1） 用20ml预热的PBSA润洗单层细胞后，加入5ml胰蛋白酶/EDTA；
（2） 将培养皿置于37℃ 2min，在10×放大倍数视野下观察单层细胞。贴壁细胞应正从塑料瓶上脱落；
（3） 将培养皿置于37℃ 2min，再次观察。重复观察直至90%的MSCs已从培养瓶中脱落下来；
（4） 加入5mlCCM，将10ml悬液移至15ml离心管中，500g离心10min；
（5） 离心完毕，弃去上清，每管用1—2ml预热的PBSA重悬沉淀。如有必要，混合多管细胞悬液只进行一次细胞计数；
3. 取10μl细胞悬液加到10μl台盼蓝中，用血细胞计数器进行计数。合适的细胞悬液浓度为（2—5）×105个细胞/ml，存活率需高于80%。胰蛋白酶消化后用于传代的早期培养物悬液，亦可进行集落形成单位（CFU）测定、冻存或分化测定；
4. 将细胞以50—100个细胞/cm的密度接种到培养皿中，保持低密度以保证快速的自我更新和多潜能特性。用预热CMM以7×103（最终浓度为50个细胞/cm2）到1×104（最终浓度为100个细胞/cm2）的密度重悬MSCs；
5. 预备适当数量的15cm培养皿，加入25ml预热的CMM；
6. 接种1ml步骤2和3所得的细胞悬液。来回滑动平皿（勿打圈）使细胞分布均匀。培养皿置于培养箱中，标记为一代细胞；
7. 培养2—3天后，观察并评价形态。MSCs应为小的、纺锤体形状，频繁折光的双联体。此为培养良好的MSCs；
8. 从培养皿中吸出培养基，用20ml预热的PBSA润洗，加入25ml预热的新鲜CMM；
9. 每次传代时所需的培养皿数量取决于可以接种的细胞数量。方案中的上述体积适用于MSCs接种单个15cm培养皿。如有需要可按此例扩大以接种多个培养皿；
