胶原酶消化法—培养脐带间充质干细胞
人脐带间充质干细胞具有高度分化潜能，基因稳定、不易突变，不会引起肿瘤；无需配型、无排异，广泛应用于疾病治疗及抗衰老研究。目前，在美容行业及针对亚健康群体的应用，也越来越引人注目。
脐带间充质干细胞脐带是由包膜、华通氏胶、脐静脉、脐动脉脐构成。脐带间充质干细胞存在于华通氏胶中。
由于存在数量少，用胶原酶消化后获取的细胞量很少。另外，一般的胶原酶消化法获取细胞时，胶原酶对细胞的伤害较大，培养出来的细胞状态差。
贴块方法培养人脐带间充质细胞是普遍采用的方法，但是，细胞从组织中爬出来的时间长（10-20天，甚至更长）。我们经过不断的摸索，找出一个用胶原酶消化获取脐带间充质干细胞的方法。
具体操作方法如下：
① 在剪断连接婴儿端和母亲的脐带后，立刻用脐带夹夹住，防止内部污染。装入无菌袋（容器）中，送进实验室。
② 在生物安全柜或超净工作台内，取出脐带，连同脐带夹用75%的酒精泡2min（50ml离心管或250px皿）。如果脐带较长，无法装入容器，可以把脐带剪成250px左右，但是剪断之前一定要用脐带夹加好，防止酒精进入脐带内部，损伤细胞。
③ 用酒精处理完，迅速移入装有PBS或生理盐水的容器中浸泡清洗2次，每次2min即可。
④ 剪掉脐带夹，把脐带剪成2-75px段，用剪刀从脐静脉内侧剖开脐带，用带齿镊子（脐带组织比较滑，用带齿镊子好操作）把脐静脉、脐动脉以及脐带包膜去除，防止杂细胞混入。
⑤ 用剪刀剪碎脐带组织，0.1%Ⅱ型胶原酶（稀释液用DMEM/F12）过夜消化，4℃过夜消化。
⑥ 第二天，把未消化完的组织倒到100目（80目、160目都可以）的钢制筛网上（最好是钢制网筛，承载的组织量大，便于操作），用PBS（或生理盐水）多次冲洗，尽可能去掉附着在组织表面上的胶原酶。最后用完全培养基冲洗1-2次，去除PBS（或生理盐水）。
⑦ 倒入皿中(放入瓶中操作不方便)，在未消化组织块上加入少量培养基培养（6ml加2-3ml、10ml加3-4ml）（其目的是减少残存胶原酶对细胞的伤害）。次日，组织块完全消失（被浸入到组织中的胶原酶消化掉了），细胞完全被分散开，显微镜下可以看到已经消化完的组织中有许多被分散的细胞。再加入少量培养基（150px加2-3ml、250px加4-5ml）加入培养基后继续培养。
⑧ 两天后继续添加少量培养基（150px加2-3ml、250px加4-5ml）培养。
⑨ 一两天后，细胞数量会有明显增加（许多成集落生长），分别移入两个50ml离心管中，加入PBS（或生理盐水）至50ml，混匀，2500rpm、6min离心。
⑩ 用5-6ml（根据细胞量）完全培养基重悬，1000rpm、6min离心，铺到T25瓶中，加入5ml完全培养基培养。
⑪ 三天后，可以换液或添加3-4ml完全培养基继续培养。之后每三天换液，直至长满（70%以上即可传代）
启示注意事项：
① 此方法具有易于操作，培养时间短的特点。
② 用胶原酶消化脐带，37℃下，数小时以内基本能够把脐带消化完，但同时对细胞的伤害较大。胶原酶能够浸透到脐带组织内部，低浓度的胶原酶从内到外消化组织，对细胞伤害较小。（胰蛋白酶对脐带组织消化效果非常差）。
③ 彻底消化完组织，并没有单独把细胞分离出来的原因，是脐带胶原成分（粘稠）会促使脐带间充质干细胞增殖。多数细胞悬浮在胶原当中，以集落方式增殖，这是铺到瓶中，细胞保持良好状态的主要原因。
④ 培养脐带间充质干细胞时，不要用带有血清的培养基（血清会促进细胞分化），而是用干细胞专用培养基。传代也尽量不用胰蛋白酶消化（胰蛋白酶对脐带间充质干细胞伤害大），应该采用专用消化液，能够保证细胞更多的传代次数。
