间充质干细胞的三系分化及鉴定操作
近年来国内外关于干细胞的研究取得了重大的突破，而这其中最热门的研究当属间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSCs）。MSC是一类具有自我更新和多种分化潜能的成体干细胞，来源于胚胎发育早期的中胚层未成熟的胚胎结缔组织。1968年德国科学家Frieden Stein在骨髓中首次发现了间充质干细胞（MSC），后来研究者陆续在全身多种组织如脂肪、脐带、牙髓中分离出了MSC。MSC属于多能干细胞，具有多向分化潜能，1999年，《科学》杂志首次报道了Pittenger等科学家在体外成功诱导了骨髓MSC分化为脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞，此后，科学家又陆续成功诱导MSC分化成为肌肉、韧带、肝、心肌和内皮等多种其它细胞（如下图）。
目前，MSC的鉴定主要通过形态学观察（如呈纤维细胞样生长，细胞中央有卵圆形核，密度较高时呈涡旋状或放射状生长）、表面标志物检测（如CD29、CD44等）以及多系分化潜能鉴定。这里的多系分化潜能通常指成骨、成脂和成软骨分化，称为MSC的三系分化。虽然目前MSC三系分化的诱导过程和鉴定方法都已经相对成熟，但三系分化的原理可能还未被大家所熟知。为了更好地理解MSC的三系分化，本文初步总结了MSC三系分化的大概过程，分化过程中出现的一些标志物以及对应的检测方法。
1 骨髓间质干细胞成骨诱导分化
间质干细胞向成骨细胞的分化是理解骨形成机制的有力工具，它也被用于鉴别骨质疏松症、骨修复和成骨不全等遗传紊乱疾病。
同其他组织器官一样，骨组织也在不断地进行着细胞代谢，称为骨代谢。它可以大致分为骨形成和骨重塑两个阶段，前者在个体生长发育期起主要作用，后者则持续整个生命周期。成骨分化是骨生成的关键步骤，即骨髓间充质干细胞经历骨原细胞（osteoprogenitor cells）、成骨前体细胞（pre-osteoblasts）、成熟的骨细胞（osteoblasts）和终末阶段的骨细胞（osteocytes）的一个复杂的过程，其中涉及到多种类型细胞间和细胞内的信号传递，如信号通路、转录因子、生长因子、MicroRNA 等，形成了一个完整的骨代谢调控负反馈环路。不同阶段的细胞群之间无明显的界限，它们是一个连续发生发展的过程。具体过程如下：
1）多种刺激因子和激素的刺激及其他特定的理化因素作用下，间充质干细胞定向分化为骨原细胞；
2）其后，骨原细胞进一步分化为成骨细胞前体细胞，进入快速增殖期;
3）细胞增殖能力逐渐下降，细胞外基质（Extracellular Matrix，ECM）成熟相关基因（碱性磷酸酶、I型胶原、基质钙蛋白）被进一步激活，成骨细胞在此阶段合成和分泌有机基质，形成类骨质，主要由I型胶原形成，特征物是碱性磷酸酶，是成骨细胞分化成熟的早期标志；
4）成熟的成骨细胞表达ECM钙化相关蛋白，主要是骨钙蛋白和骨桥蛋白，成骨细胞矿化活力显著升高。
与成骨分化的体内过程相对应的，体外诱导成骨分化的鉴定主要是通过检测成骨细胞的生物学标志以及相关的标志基因来进行的。短期的成骨分化可通过碱性磷酸酶来检测，长期的成骨分化则通过检测茜红素染色骨结节来鉴定。具体检测以下三种物质：
1）碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）：碱性磷酸酶经固蓝染色后在显微镜下呈现蓝色，未分化的细胞则无明显颜色。可通过统计各样品中细胞碱性磷酸酶的平均表达强度对其成骨能力进行评估对比。可通过统计各样品中成骨分化细胞的百分比加以对比或统计ALP染色照片的平均灰度（固定各项拍摄参数）进行对比，还可通过溶解蓝色物质后测吸光度。
2）“钙结节”：长时间的成骨诱导会使钙离子以钙盐方式沉淀下来，形成“骨结节”。骨结节可通过茜素红染色（茜素红和钙发生显色反应，产生一种深红色化合物），把外面沉积的钙结节染成深红色，通过着色物面积和深浅来表示成骨分化的强弱。
3）MSC成骨分化后明显的成骨细胞特征性基因，如ALP，Runx（runt related gene II）等。可使用RT-PCR对比不同实验组别的成骨分化差异。
赛业生物长期致力于干细胞领域的研究，在干细胞的诱导分化中有专业的技术及丰富经验，依赖于成熟的干细胞技术平台，我们可以开展多种干细
胞成骨诱导分化潜能研究的实验服务。下图是赛业所做的骨髓间充质干细胞的成骨分化诱导图，图中深红色部分为钙结节。
2 骨髓间质干细胞成脂诱导分化
脂肪组织由脂肪细胞组成，对保持能量和代谢平衡非常重要。脂肪组织有两种，一种为白色脂肪组织（WAT），主要分布在皮下和内脏，内脏白色脂肪与肥胖、病理验证和胰岛素抵抗相关，皮下白色脂肪则可提高葡萄糖耐受性；另一种为棕色脂肪组织（BAT），主要呈离散状分布在脊椎旁、锁骨和肾上腺，功能是产热。这两种脂肪组织有相同的分化特征，都是由间充质干细胞分化而来。
间充质干细胞成脂分化有两个阶段，先是MSC分化为脂肪前体细胞，接着在特定的细胞刺激影响下（如C/EBPs和PPAR-γ）最终分化为脂肪细胞，出现脂肪细胞中显著的标志物（脂肪滴），如下图：
体外诱导成脂分化的鉴定
1.检测成脂诱导后细胞的胞浆中的油滴（脂肪滴）。脂肪滴经油红O染色后在显微镜下呈现显著的红色，未分化细胞则无明显颜色。通过统计各样品中成脂分化细胞的百分比来对成脂分化强弱加以表征对比。
2.MSC成脂分化后有明显的成脂特征性基因表达，如LPL、PPARγ等。可使用RT-PCR通过对相关基因表达量的测量，对比不同实验组别的成脂分化差异。
赛业生物长期致力于干细胞领域的研究，在干细胞的诱导分化中有专业的技术及丰富经验，依赖于成熟的干细胞技术平台，我们可以开展多种干细胞成脂诱导分化潜能研究的实验服务。下图是公司所做骨髓间充质干细胞的成脂分化诱导图，可以看到图中有明显的脂肪滴。
3 骨髓间质干细胞成软骨诱导分化
软骨的破坏、缺失是包括骨关节炎（osteoarthritis，OA）在内的多种骨科疾病的重要病理改变。由于软骨特殊的解剖及组织特性，如缺乏血管和淋巴管的分布，使得其自我修复能力异常不足，因此通过人工方法修复软骨破坏具有重要临床意义。近年来，随着间充质干细胞的发现和研究深入，其来源广泛、良好的增殖能力、多分化潜能、与各种3D支架材料具有良好的生物相容性等特性，使得其在软骨修复应用中具有令人期待的潜力。
MSC成软骨分化的过程：MSC首先收回其突起，聚集成团，这个团中间的细胞经分裂分化转变成一种大而圆的细胞，即成软骨细胞；成软骨细胞产生基质和纤维（主要为II型胶原蛋白），当基质的量增加到一定程度时，成软骨细胞被分隔在陷窝内，分化为成熟的软骨细胞。
体外诱导成软骨分化的鉴定主要围绕成软骨的标志物——II型胶原蛋白来进行，包括通过免疫组化、Westernblot检测II型胶原蛋白的表达和RT-PCR检测II型胶原蛋白的mRNA的表达，不同的角度进行鉴定；而甲苯胺蓝则主要检测成软骨细胞内酸性粘多糖。
赛业生物长期致力于干细胞领域的研究，在干细胞的诱导分化中有专业的技术及丰富经验，依赖于成熟的干细胞技术平台，我们可以开展多种干细胞成脂诱导分化潜能研究的实验服务。下图是公司所做骨髓间充质干细胞的成软骨分化诱导图，可以看到软骨细胞埋藏在软骨间质内，它所存在的部位为一小腔，称为软骨陷窝（cartilage lacuna）。
自我更新能力和多向分化能力是干细胞的两个最基本特征。干细胞诱导分化是干细胞鉴定的主要方法，也是干细胞功能学研究的主要途径。赛业生物长期致力于干细胞领域的研究，在干细胞的诱导分化中有专业的技术及丰富经验，依赖于成熟的干细胞技术平台，我们可以为您开展多种干细胞分化潜能研究的实验服务。其中OriCell®干细胞诱导培养基针对干细胞多向诱导分化添加了特殊的诱导物质，能高效促进干细胞分化；同时，针对不同种属和来源的间充质干细胞（MSCs）公司研发出了相应的人间充质干细胞检测试剂盒、大鼠间充质干细胞检测试剂盒、小鼠充质干细胞检测试剂盒，以满足大多数科研工作者的需要。
参考文献
周雷，王明海，《成骨分化相关信号通路的研究进展》
张静如，逢丹丹，戴生明《成骨细胞分化及调节过程》
虞翼哲董学海，陈海丹，赵红卫《间充质干细胞应用于软骨组织工程的研究进展》
Cristancho AG, Lazar MA. Forming functional fat: a growing understanding of adipocyte differentiation. Nat Rev Mol Cell Biol. 2011;12(11):722-734. Published 2011 Sep 28. doi:10.1038/nrm3198
