PCR污染的处理（三）
（二）反应液污染
可采用下列方法之一处理：
1. DNase I法：PCR混合液（未加模板和Taq聚合酶）加入0.5U DNase I，室温反应30 min后加热灭活，然后加入模板和Taq聚合酶进行正常PCR扩增。该方法的优点是不需要知道污染DNA的序列；
2. 内切酶法：选择识别4个碱基的内切酶（如Msp I和Taq I等），可同时选择几种，以克服用一种酶只能识别特定序列的缺陷，室温作用1h 后加热灭活进行PCR；
3. 紫外照射法：未加模板和Taq聚合酶的PCR混合液进行紫外照射，注意事项与方法同上述UV照射法；
4. g射线辐射法：1.5kGy的辐射可完全破坏0.1ng基因组DNA，2.0 kGy可破坏104拷贝的质粒分子，4.0 kGy仍不影响PCR，但高于此限度会使PCR扩增效率下降。引物可受照射而不影响PCR，g射线是通过水的离子化产生自由基来破坏DNA的。
（三）尿嘧啶糖苷酶（UNG）法
由于UV照射的去污染作用对500bp以下的片段效果不好，而临床用于检测的PCR扩增片段通常为300bp左右，因此UNG的预防作用日益受到重视和肯定。
1. 原理：在PCR产物或引物中用dU 代替dT。这种dU化的PCR产物与UNG一起孵育，因UDG可裂解尿嘧啶碱基和糖磷酸骨架间的N-糖基键，可除去dU而阻止TaqDNA聚合酶的延伸，从而失去被再扩增的能力。UNG对不含dU的模板无任何影响。UNG可从单或双链DNA中消除尿嘧啶，而对RNA中的尿嘧啶和单一尿嘧啶分子则无任何作用。
2. dUTP法：用dUTP代替dTTP，使产物中掺入大量dU。在再次进行PCR扩增前，用UNG处理PCR混合液即可消除PCR产物的残留污染。由于UNG在PCR循环中的变性一步便可被灭活，因此不会影响含dU的新的PCR产物。
3. dU引物法：合成引物时以dU 代dT，这样PCR产物中仅5ˊ端带dU。UNG处理后，引物失去了结合位点而不能扩增。对长片段（1-2kb以上）的扩增用dUTP法效率较用dTTP低，而用dU法就可克服这一缺点。dU引物最好将dU设计在3ˊ端或近ˊ端。该法仅能用于引物以外试剂的处理。
4. 优点：可以去除任何来源的污染；UNG处理可以和PCR扩增在同一个反应管内进行；由于扩增产物中有大量dU存在，可彻底消除污染源。
5. 需注意的是掺入dUTP的DNA不应对产物的任何操作有影响，在进行PCR产物克隆时，应该转化UNG-（UNG缺陷）大肠杆菌受体菌，否则转化产物会被受体菌UNG消化掉。
（四） 固相捕获法
用于去除标本中污染的核酸和杂质，原理如下：1）用一生物素标记的单链RNA探针与待扩核酸杂交，杂交区域是非扩增区；2）用包被链霉亲和素的固相载体来捕获带有生物素探针的杂交核酸，通过漂洗可去除污染的扩增产物和杂质；3）洗脱靶分子后用特异引物扩增非RNA探针杂交区域。第2）步的漂洗后可用PCR检测以确定标本是否被扩增产物或重组质粒污染。
（五）RS-PCR法（RNA-specific PCR）
也称为链特异性PCR，主要指用于RNA模板的特异性PCR法，该法可明显降低假阳性而不影响PCR的敏感性。其关键在于设计引物，逆转录引物的3ˊ端（A区）有2 0个核苷酸左右为模板的特异性互不序列，5ˊ端2 0个核苷酸（C区）为附加修饰碱基。与mRNA逆转录后，经超速离心使 cDNA与多余引物分开，再用和第二引物（C）以第一链cDNA为模板合成第二链cDNA，以后的PCR循环中用逆转录引物的B区和引物C进行扩增加尾cDNA，而污染的DNA或质粒DNA才不会被扩增。
（六）抗污染引物法
该对引物扩增时通过病毒DNA克隆如入质粒的位点。这一区域只存在完整的原病毒中，在重组质粒中，这一区域分成两个区域与克隆位点被。如果重组质粒污染了标本，也不能扩增出任何条带，即使出现了扩增带，其大小也与预期的不同。只有原病毒DNA才能被引物扩增，因此只要出现预期大小的扩增带就可以证明标本是阳性的，该法试用于环状靶分子系列。
四．其它PCR检测方法：
（一） 两步法：是指在用套式PCR方法扩增某些含量低微的标本时，两对引物在同一个管中以简化步骤，减少污染。通常第一步进行20-25个循环，扩增外引物片段；第二步再进行10个循环，扩增内引物片段。两步法对内外引物的Tm值有特殊要求，即内外引物的退火温度高（如68℃），在此温度下内引物不与模板退火，然后降低退火温度（至55℃）再扩增内引物片段，这样，在操作过程中，仅打开PCR反应管一次，大大减少了污染的可能性。
（二） 荧光法：亦称荧光PCR技术（fluoresence PCR, F-PCR），是1995年由美国PE公司首先研制成功的，它融汇了PCR的灵敏性、DNA杂交的特异性和光谱技术精确定量的优点，电脑同步跟踪，数据自动化处理，直接探测PCR过程中的变化以获得定量的结果，不需要做PCR后处理或检测，完全闭管操作。探针标记除用TET和FAM外，还可用HEX、JOE作为报告荧光，3′端的淬灭基团常用TAMRA。在探针保持完整时，荧光报告基团的荧光被荧光抑制基团淬灭，而在探针被切断后，荧光报告基团才发出报告荧光，且荧光的强度与PCR产物的数量呈正比。荧光检测仪器透过PCR管壁能直接检测到荧光信号的波长和长度变化。
主要有以下优点：
1.探针特异性强，假阳性率低；
2.操作快速，不需要PCR后处理；
3.定量范围宽，HBV 0.4fg-4000fg/ml(102-106 Dane′s particle/ml)；
4.闭管操作，PCR产物污染少；
5.灵敏度高。
主要方法有：
1..荧光探针法：进行荧光PCR检测时，要求荧光探针必须完全与靶基因互补，长度以20-30个碱基为宜，必要时3′端磷酸化封闭，以防在扩增时作为引物延伸。该方法利用Taq酶的3′→5′聚合酶活性及5′→3′外切酶活性，可以在链延伸过程中实现链替换，并将被替换的探针切断，故可进行定性与定量检测。
荧光探针5′端标记的TAMRA，在480nm激发下产生530nm的红色荧光；3′端标记的FAM，激发后产生绿色荧光。PE公司推出的TaqMan系统，即采用双荧光探针，如配合使用PCR扩增与荧光检测合二为一的仪器，可进行实时（real-time）定量检测。
2．分子信标法：分子信标（molecular beacon）是一个发夹样结构的特异探针，其环状部分与靶序列互补。在室温时，分子信标的发夹紧闭，荧光淬灭。PCR扩增时，随着温度升高，发夹松开，与单链模板特异结合，发出荧光。荧光强度与模板呈正比，故可用于PCR产物的定性及定量。
总之，人类在迈入廿一世纪中即将出现若干的突破，生物医学便是其中重要的一项。在过去三、四十年耒，像PCR这样影响深远的技术实在很难找到。它的震撼, 除了众多的得奖外(包括诺贝尔奖),更在于它的可塑性、修饰性及全方位的运用。未来的生物医学领域中，它也必定继续扮演举足轻重的角色。
