PCR实验中的污染预防及处理（三）
1. 原理：在PCR 产物或引物中用dU 代替dT。这种dU 化的PCR 产物与UNG
一起孵育，因UDG 可裂解尿嘧啶碱基和糖磷酸骨架间的N-糖基键，可除去dU 而阻止TaqDNA 聚合酶的延伸，从而失去被再扩增的能力。UNG
对不含dU 的模板无任何影响。UNG 可从单或双链DNA 中消除尿嘧啶，而对RNA 中的尿嘧啶和单一尿嘧啶分子则无任何作用。
2. dUTP 法：用dUTP 代替dTTP，使产物中掺入大量dU。在再次进行PCR 扩增前，用UNG 处理PCR 混合液即可消除PCR
产物的残留污染。由于UNG 在PCR 循环中的变性一步便可被灭活，因此不会影响含dU 的新的PCR 产物。
3. dU
引物法：合成引物时以dU 代dT，这样PCR 产物中仅5ˊ端带dU。UNG 处理后，引物失去了结合位点而不能扩增。对长片段（1-2kb
以上）的扩增用dUTP 法效率较用dTTP低，而用dU 法就可克服这一缺点。dU 引物最好将dU
设计在3ˊ端或近ˊ端。该法仅能用于引物以外试剂的处理。
4. 优点：可以去除任何来源的污染；UNG 处理可以和PCR 扩增在同一个反应管内进行；由于扩增产物中有大量dU 存在，可彻底消除污染源。
5. 需注意的是掺入dUTP 的DNA不应对产物的任何操作有影响，在进行PCR 产物克隆时，应该转化UNG-（UNG 缺陷）大肠杆菌受体菌，否则转化产物会被受体菌UNG 消化掉。
（四）固相捕获法
用于去除标本中污染的核酸和杂质，原理如下：1）用一生物素标记的单链RNA 探针与待扩核酸杂交，杂交区域是非扩增区；2）用包被链霉亲和素的固相载体来捕获带有生物素探针的杂交核酸，通过漂洗可去除污染的扩增产物和杂质；3）洗脱靶分子后用特异引物扩增非RNA 探针杂交区域。第2）步的漂洗后可用PCR 检测以确定标本是否被扩增产物或重组质粒污染。
（五）RS-PCR 法（RNA-specific PCR）
也称为链特异性PCR，主要指用于RNA 模板的特异性PCR 法，该法可明显降低假阳性而不影响PCR 的敏感性。其关键在于设计引物，逆转录引物的3ˊ端（A 区）有2 0 个核苷酸左右为模板的特异性互不序列，5ˊ端2 0 个核苷酸（C 区）为附加修饰碱基。与mRNA逆转录后，经超速离心使cDNA 与多余引物分开，再用和第二引物（C）以第一链cDNA为模板合成第二链cDNA，以后的PCR 循环中用逆转录引物的B 区和引物C 进行扩增加尾cDNA，而污染的DNA 或质粒DNA 才不会被扩增。
（六）抗污染引物法
该对引物扩增时通过病毒DNA克隆如入质粒的位点。这一区域只存在完整的原病毒中，在重组质粒中，这一区域分成两个区域与克隆位点被。如果重组质粒污染了标本，也不能扩增出任何条带，即使出现了扩增带，其大小也与预期的不同。只有原病毒DNA 才能被引物扩增，因此只要出现预期大小的扩增带就可以证明标本是阳性的，该法试用于环状靶分子系列。
附录: 各种碱基符号
在设计简并引物或测序时你可能会碰到这样的符号来表示碱基：
B = C or G or T
D = A or G or T
H = A or C or T
K = G or T
M = A or C
N = A or C or G or T
R = A or G
S = C or G
V = A or C or G
W = A or T
Y = C or T
