蛋白质纯化的内容提要
一、亲和纯化样品的前处理
1. 菌液体积-起始目的蛋白量
2. 细菌裂解获得可溶蛋白
· BugBuster Master Mix 蛋白抽提方法
· 机械破碎（如超声等）Ni-NTA 树脂纯化
二、亲和纯化步骤
1. Ni-NTA树脂的兼容性
2. 天然条件纯化
· 柱层析
· FPLC
· 批次小量纯化
3. 变性条件的纯化
· 柱层析
· FPLC 纯化
· 批次小量纯化
4. 树脂再生
5. 常见问题与改善建议
一、亲和纯化样品的前处理
1. 菌液体积-起始目的蛋白量
纯化条件的优化需考虑多个因素，包括His·Tag 融合蛋白表达水平和上样量。若目的蛋白未能高效表达，需要采
用一个较高的浓缩系数（concentration factor）进行菌的裂解，即在较大培养体系中，按一定比例加入一定体积
的裂解/结合缓冲液。浓缩系数定义为菌液体积与裂解/结合缓冲液体积之比。不同目的蛋白表达水平推荐使用的
裂解/结合缓冲液体积、对应的浓缩系数大小，请参考表1。
例如，某蛋白表达水平约为0.1mg/ml，需要在变性条件下进行小批提纯，则100ml 的培养物离心获得的菌体，
按浓缩100 倍比例重悬于含变性剂的1ml 裂解/结合缓冲液中。
在非变性条件下进行纯化时，要准确预计裂解液中可溶蛋白的含量比较困难，一般建议采用50-100 倍浓缩。
表1 确定所需菌液体积
His·Tag融合蛋白浓度表达水平培养体积 His·Tag融合
蛋白总量
浓缩系数
（在1ml溶液中裂解后）
变性条件
50mg/L 40% 3ml 150μg 3×
10mg/L 8% 10ml 100μg 10×
2mg/ L 1.6% 25ml 50μg 25×
0.5mg/ L 0.4% 50ml 25μg 50×
0.1mg/ L 0.8% 100ml 10g 100×
天然条件
>1mg/ L >1% 50ml >50g 50×
<1mg/ L <1% 100ml <100g 100×
与其它亲和纯化介质一样，His·Bind 树脂在接近其结合载量时使用，可以获得最好蛋白分离效果。所以在蛋白纯化前估计细菌
抽提物中目的蛋白的含量，有利于确定上样量、选择合适体积的亲和树脂或预装柱。SDS-PAGE，Western blot，S·TagTM
Rapid Assay，FRETWorksTM S·Tag Assay 等方法都可用于确定抽提物中目的蛋白的含量。
2. 细菌裂解获得可溶蛋白
· BugBuster Master Mix蛋白抽提方法
BugBuster Master Mix（货号71456）是将BugBuster蛋白抽提试剂，Benzonase核酸酶和rLysozyme™溶菌酶溶
液按最优化配比混合好的一种非常方便使用的蛋白抽提试剂，有助于在最优化条件下获得可溶活性蛋白。这种预
混形式的试剂减少了稀释试剂、计算各种试剂使用量和分别添加的麻烦。100ml和500ml包装分别足够用于20g和
100g细胞沉淀的可溶蛋白抽提。
可溶蛋白制备
采用此操作抽提到的蛋白包括来自细胞周质和细胞质的可溶蛋白。如果欲仅收集周质部分蛋白，可以参考
Novagen的TB055“PET系统操作手册”中提到的渗压休克方法或其它合适的方法。渗透休克方法中得到的沉淀
也可以用于以下操作以获得细胞质中的可溶蛋白。
1. 用经预先称重的离心管10,000g离心10分钟从液体培养体系收集细胞。如果是小规模培养（如1.5ml或更
少），可以用1.5ml离心管14,000–16,000g离心。尽量倾去液体，称量细胞沉淀湿重。
2. 室温下用吸打或温和涡旋使BugBuster Master Mix与细胞沉淀混匀，每克细胞糊需要5ml抽提试剂。这相当于
50ml培养液采用2.5ml抽提试剂。如果是小规模培养，则采用约1/5培养体积的抽提试剂重悬沉淀（例如，
1.5ml培养液采用300μl抽提试剂）。如果抽提试剂过量也没有什么副作用。
选做：加蛋白酶抑制剂。BugBuster Master Mix与蛋白酶抑制剂兼容。如果目的蛋白后续要用凝血酶（货号
69671），Xa因子（货号69036）或重组肠激酶（货号69066）处理，就应该避免使用丝氨酸蛋白酶抑制剂。尽
管纯化过程可能去除活性抑制剂，建议在酶切前最好做透析或凝胶过滤。
3. 室温下将重悬的细胞液在摇板或低速搅拌器上孵育10-20分钟。
注意：孵育后获得的抽提物不是粘稠的。
4. 4℃下16,000g离心20分钟以去除不溶的细胞碎片。如果需要，沉淀可以留作“包涵体纯化”（见以下说明）
的材料。
5. 将上清转入另一个新试管。这样抽提得到的可溶蛋白溶液可以直接上样于Novagen的纯化树脂（以及其它很
多类似纯化系统）。蛋白溶液在冰上可以短时存放（2-3小时），也可在-20℃长时间存放直至下步分析。蛋
白抽提液应该根据目的蛋白的活性要求的温度存放，有些蛋白经冻融会失活。
高纯度包涵体的制备
以下操作可用于任何BugBuster®系列产品抽提的包涵体纯化。
1. 如可溶蛋白抽提步骤1-4进行操作。
2. 将步骤“4”所得到的沉淀重悬于BugBuster（货号70584），BugBuster的量与当初重悬细胞糊的体积相同。
吸打并涡旋以获得均匀的悬浮液。充分重悬沉淀能够溶解、去除杂蛋白以获得高纯度的包涵体。
3. 加入rLysozyme™溶液至终浓度为1KU/ml。温和涡旋混匀，室温孵育5分钟。
注意：如果采用的是BugBuster Master Mix就不需要另加rLysozyme了（即可省去此步操作）。
4. 加入6倍体积的经1:10去离子水稀释的BugBuster重悬，涡旋1分钟混匀。
5. 于4℃，5,000g离心15分钟，以吸管移去上清，收集包涵体。
6. 将包涵体重悬于相当于原培养体系体积一半的经1:10稀释的BugBuster中，涡旋混匀，如步骤5离心。此步骤
重复两次。再次重悬，于4℃，16,000g离心15分钟并去除上清。
7. 重悬最终的沉淀（即纯化的包涵体）于选定的缓冲液，最好是能与后续纯化方法兼容的缓冲液。包涵体可以
重悬于Novagen的蛋白重折叠试剂盒（货号70123）中的1×溶解缓冲液（参考操作手册TB234）或其它变性
剂。不溶的His•Tag®融合蛋白可以用含有变性剂的1×结合缓冲液重悬用于His•Bind®纯化（IDA或NTA）。
机械破碎（如超声等）
可溶蛋白的制备
稀释8×储液制成1×结合缓冲液，或按照缓冲液成分列表自己配制（参考Novagen 目录或树脂英文说明书）。
1. 10,000g 离心10 分钟收集菌体。弃上清，尽量去除培养基。按每100mI 培养基所得菌体加入4ml (1:25 v/v)
缓冲液，重悬于冰浴预冷的1×结合缓冲液或1×Fractogel 结合缓冲液中。也可加入NP-40 或其他非离子型
去污剂至终浓度0.1％，以减少非特异性结合。若细菌菌体重悬困难，可使用匀浆器、搅拌器或超声仪帮助打
散菌体。
2. 将重悬菌液置于合适大小的容器中，超声破碎。超声过程中保持菌液处于冰浴或盐冰浴中。超声条件依赖于
所使用的超声仪功率、探头种类、容器的大小形状，须实验者自己摸索。应避免连续超声导致的大量产热，
可分成短时间、多次超声。通过一定的间隔时间避免溶液过热。若DNA 未能被超声剪切，裂解液会十分粘
稠，可能阻塞色谱柱，降低流速，影响后续的纯化过程。大量的菌体可选用弗氏压碎法(French Press)。
包涵体的制备
使用1×结合缓冲液从大肠杆菌中分离、洗涤包涵体，除去杂质蛋白，再用含6M 盐酸胍或6M 尿素的1×结合缓
冲液溶解包涵体。
1. 10,000g 离心10 分钟收集菌体。弃上清，尽量去除培养基。按每100mI 培养基所得菌体加入40mI 1×结合
缓冲液比例重悬菌体。此步骤不加变性剂。
2. 按前述方法进行超声，重悬菌液，剪切降解核酸。
3. 5,000g 离心15 分钟，包涵体和细胞碎片位于沉淀中。其他可溶蛋白部分位于上清中。
4. 移去上清，每100ml 培养物的沉淀重悬于20ml 1×结合缓冲液，重复第3 步。可能需要超声以彻底重悬沉
淀。
注意： 本步操作可加入rLysozymeTM溶液（非必要）帮助处理包涵体。已证实溶菌酶可消化细胞壁，提高包涵体
纯度。将rLysozyme 加入1×结合缓冲液至终浓度1KU/ml，轻柔混匀，孵育5-10 分钟即可离心。
5. 移去上清，按每100ml 培养物加5mI 缓冲液比例，加入含6 M 盐酸胍或6 M 尿素的1×结合缓冲液重悬沉
淀。
6. 冰浴孵育1 小时，彻底溶解包涵体。16,000g 离心30 分钟去除不溶成分，His·Bind 纯化之前用0.45um 滤膜
过滤上清。
二、亲和纯化步骤
Ni-NTA 树脂纯化
Ni-NTA His·Bind 树脂不能耐受高浓度还原剂，如DTT、DTE，这些还原剂会还原Ni 离子，使其无法与His·Tag
融合蛋白结合。被还原的树脂呈棕色。多数情况下，可以使用巯基乙醇，其浓度可以加至20mM。
EDTA、EGTA，或其它强螯合剂会与Ni2+结合，将其从树脂上剥离下来。Ni2+被螯合后，树脂呈白色。
对任何还原剂或螯合剂，请小心对待。若不能确定，请先在小量树脂上进行试用。应尽量避免缓冲液中含有任何
高浓度供电子基团成分(如NH4+)、或裂解物中含诸如Arg、GIn、Gly、His 等氨基酸。
菌体应在无强螯合剂(如EDTA)、无强还原剂(如DTT)、无离子型去污剂(如SDS)的情况下裂解。尽管确实存在某
些例子，在这些试剂存在的情况下成功纯化出目的蛋白，但还是建议大家避免使用这些试剂。
更多信息请参考2。
2. 天然条件纯化
在决定使用天然条件（非变性条件）进行蛋白纯化之前，首先需要确定蛋白是否可溶。即使目的蛋白大部分以不
溶形式表达，仍有可能有少量可溶蛋白可以用 Ni-NTA His·Bind 树脂纯化出来。
在没有强变性剂如尿素的情况下，细胞裂解物中部分不稳定的蛋白可能容易被降解。最好始终保持蛋白溶液处于
低温0-4℃，并快速操作。加入AEBSF 或蛋白酶抑制剂混合物系列III 货号101500 和 539134），可能帮助蛋白
稳定（视具体情况而定），但是需要考虑到它们对重组蛋白的可能影响。
天然条件纯化所需缓冲液（试剂盒70899）
1×Ni-NTA 结合缓冲液：（用于裂解和结合步骤）
50mM NaH2PO4，pH 8.0，300mM NaCl，10mM 咪唑
（加入1/10 体积的10×BugBuster 或溶菌酶能获得更好裂解效果。参见前述“制备细菌裂解物”部分。）
1×Ni-NTA 漂洗缓冲液：50mM NaH2P04，pH 8.0，300mM NaCI，20mM 咪唑
1×Ni-NTA 洗脱缓冲液：50mM NaH2PO4，pH8.0，300mM NaCI，250mM 咪唑
柱
2. 天然条件纯化
在决定使用天然条件（非变性条件）进行蛋白纯化之前，首先需要确定蛋白是否可溶。即使目的蛋白大部分以不
溶形式表达，仍有可能有少量可溶蛋白可以用 Ni-NTA His·Bind 树脂纯化出来。
在没有强变性剂如尿素的情况下，细胞裂解物中部分不稳定的蛋白可能容易被降解。最好始终保持蛋白溶液处于
低温0-4℃，并快速操作。加入AEBSF 或蛋白酶抑制剂混合物系列III 货号101500 和 539134），可能帮助蛋白
稳定（视具体情况而定），但是需要考虑到它们对重组蛋白的可能影响。
天然条件纯化所需缓冲液（试剂盒70899）
1×Ni-NTA 结合缓冲液：（用于裂解和结合步骤）
50mM NaH2PO4，pH 8.0，300mM NaCl，10mM 咪唑
（加入1/10 体积的10×BugBuster 或溶菌酶能获得更好裂解效果。参见前述“制备细菌裂解物”部分。）
1×Ni-NTA 漂洗缓冲液：50mM NaH2P04，pH 8.0，300mM NaCI，20mM 咪唑
1×Ni-NTA 洗脱缓冲液：50mM NaH2PO4，pH8.0，300mM NaCI，250mM 咪唑
柱
批次小量纯化
实验材料
·小离心管
·溶菌酶（货号71110）
·Ni-NTA His·Bind 树脂（货号70666）
·1×Ni-NTA 结合缓冲液（缓冲液试剂盒货号70899）
·1×Ni-NTA 漂洗缓冲液
·1×Ni-NTA 洗脱缓冲液
1、取1ml 菌液，加入一个小离心管中。
需要破碎多少菌体依赖于目的蛋白的表达水平。若蛋白高水平表达，1ml 菌液所含目的蛋白就足够了（参考表
1）。若蛋白表达水平低，可能需要更大体积的菌液。若需要检测诱导培养时间对蛋白表达水平的影响，每隔30
分钟从培养体系中取出1ml 菌液，离心收集菌体，-20℃保存，直至所有样品收集完全。
2、15,000g 离心1 分钟，收集菌体，弃上清。
若需要更大体积的菌液，可向离心后去除上清的离心管中再加入菌液，再次离心，从而获得更多菌体。
3、将细胞沉淀在-20C 冷冻15-20min。
4、将细胞完全解冻，用100μl 1×Ni-NTA 结合缓冲液重悬菌体。
若仅取1ml 菌液，浓缩系数为10，对于某些需要在天然条件下纯化的蛋白来说可能不够，请参考表 1 。
5、加入溶菌酶4.5-6KU 30 度孵育15min。
6、轻柔涡旋，裂解细胞，避免起泡。
可选做：每100μl 重悬细胞加入2.5u Benzonase 核酸酶。可将Benzonase 稀释10 倍（2.5u/ul）以方便取用
（稀释缓冲液请垂询）。
7、裂解物15,000g 离心10min。除去细胞不溶残片，上清转入干净小管中。
8、每管加入 20μl 50% Ni –NTA His·Bind 树脂悬液（相当于 10μl 树脂，可结合50-100μg His·Tag®融合蛋
白），4℃轻柔混匀，结合30 分钟。
9、15,000g 离心10 s 沉淀树脂，取 10μl 上清转入另一干净小管中，以备电泳分析。弃去其它上清。
上清留样保存于冰上。
3. 变性条件的纯化
变性条件纯化所需缓冲液
变性裂解／结合缓冲液
Buffer A：6M Gu-HCI；0.1M NaH2P04 ；0.01M Tris-CI，pH8.0
Buffer B：8M 尿素；0.1M NaH2P04；0.01M Tris-CI，pH8.0
变性漂洗缓冲液
Buffer C：8M 尿素；0.1M NaH2P04；0.01M Tris-CI pH6.3
变性洗脱缓冲液
Buffer D：8M 尿素；0.1M NaH2P04；0.01M Tris-CI pH5.9
Buffer E：8M 尿素；0.1M NaH2P04；0.01M Tris-CI pH4.5
注意：Buffer B、C、D、E应在使用前调至适宜pH值，以避免尿素解离。
柱层析
实验材料
· 变性裂解／结合缓冲液裂解制备的细菌裂解物（ 20-200ml 菌液体积）。
· Ni-NTA His·Bind 树脂（货号70666）
· 空色谱柱（货号69673）
· Buffers A -E
1、将 1ml 50% Ni-NTA His·Bind 树脂悬液加到 4ml 细胞裂解液中，轻柔混匀（如旋转混合器200rpm ） ，室
温结合15-60min。
需要破碎多少菌体根据所使用的表达体系和His·Tag®融合蛋白的表达水平。Ni-NTA His·Bind 树脂与不同的
His·Tag®融合蛋白的结合能力不同，通常为5-10 mg/ml 。如 Ni-NTA His·Bind 树脂或Ni-NTA His·Bind
Superflow 对 His·Tag DHFR（～26 kDa）的结合量为 0.3μmol/ml （8.0 mg/ml ）。请参考表 1。对于高表达水平的目的蛋白（每升培养基 50-100mg His·Tag 融合蛋白），可用5 倍浓缩的细菌裂解物（如
20ml 菌液离心获得的菌体重悬于4ml Buffer B ）。4ml 5 倍浓缩的裂解物含有约1-2mg 的 His·Tag 融合蛋白。
对于低表达水平的蛋白（ 1-5 mg/1 培养基），可以50 倍浓缩，抽提 200ml 菌液，获得 4ml 的细菌裂解物（4ml
细菌裂解物＝0.2-1mg His·Tag 融合蛋白）。
2、将裂解液与Ni-NTA His·Bind 树脂的混合物小心加入下端封闭的空色谱柱中。
3、除去柱下端封闭盖子，收集流出液（穿过峰），保存用于SDS -PAGE 电泳分析。
4、以 4ml buffer C 漂洗杂蛋白2 次。
保存漂洗组分用于SDS -PAGE 电泳分析。
5、以 0.5ml buffer D 洗脱目的蛋白4 次，再以0.5ml buffer E 洗4 次，收集组分，用SDS-PAGE 分析。
蛋白单体通常用 buffer D 即可洗脱，而多聚体、聚合物和含两个His·Tag 标签的蛋白通常由buffer E 洗脱。
