【求助】3T3L1分化时飘了，越飘越多，分化不成功

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• 雪花子 (2015-10-14 16:33:19)

  
  但今年开学一连复苏了3管细胞，均是分化前一切OK，分化第一天细胞状态也都正常，但到第2天，细胞就开始出现飘的多，飘细胞内出现浓缩颗粒，类似凋亡细胞，接下来就慢慢的飘的更多了，基本不分。
  给看一张第一天的细胞，形态都很正常。细胞变圆，两头出现长长的细丝，我给取了个名字叫“双尾蝌蚪”，只要出现这样形态，我就放下了90%的心，但这次不同，虽然第一天很好，到第二天细胞就开始飘，越飘心越凉啊……

  
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• 雪花子 (2015-10-14 16:33:37)

  
  这是第2天的情形，看箭头所指，圆形漂浮的细胞，胞内可见固缩的高密度物质，极像凋亡细胞！
  同时把以前分化很好的图片给大家做一个对照！左图正常分化中：细胞变圆，变大，长出细长触手，而右图细胞轮廓不清，出现漂浮细胞！！！！

  
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• 雪花子 (2015-10-14 16:34:49)

  
  到了第4天，基本就放弃了，大部分细胞没有分出来，我都快要郁闷死了。
  左图正常分化中，细胞进一步变大，变圆，不分细胞内可以看见小的脂滴；右图中细胞轮廓不清，漂浮细胞多见，完蛋了。

  
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• 雪花子 (2015-10-14 16:35:32)

  
  细胞都是1年半之前，09年4月协和细胞库买来后就冻存的，当时大量冻存在液氮罐中，大约有百十来管，就是为了防止细胞老化后分化不好的问题，代数在10代以内，之前复苏分化一直没有问题。前脂肪细胞生长没有问题，同学用作增殖模型，我复苏后传给她的，如MTT实验，都有效应，并和以前实验结果可以重复。
  我这学期复苏了3次细胞，因为每次都怀疑是细胞种子不好，可能换一管就可以了。看来不是细胞的问题，试剂是否有问题？
  分化的试剂IBMX是这学期刚分装的，都是Sigma定的，方法和最开始一样，应该不会出问题。但胰岛素和地塞米松都是细胞买回来时分装的，冻存在﹣20度，已经放置了1年半，所以只能怀疑是胰岛素和地塞米松过期的问题，我现在已经重新订购了胰岛素和地塞米松，准备换试剂后再试试！
  只能走一步看一步了。
  我会持续更贴告诉大家最新进展的。但这个细胞分化真是个漫长的过程， 一次就要15-20天的周期，不成就要重头来，真能把人给逼疯了 ！！

• 雪花子 (2015-10-14 16:35:54)

  
  我已经无计可施了，我重新配了胰岛素，地塞米松，IBMX,我更换了培养基，更换了血清，能check的我都check了，都没有改变。都没有心情写了……
  现在只剩下细胞了，今天刚打了电话，重新订购了3T3L1，从协和细胞库，如果买来的细胞还不成，实验作了大半，进退维谷，我明年6月是毕不了业了，我退学算了，反正在哪都是被人剥削，都一样，疯了，死的心都有了！！！

• summerxx (2015-10-14 16:36:14)

  
  3T3L1的分化对培养环境非常敏感，甚至是trypsin的质量都会影响分化。你这个现象比较诡异，换了这么多还不行，结合你的描述，细胞还大量飘起，多半是细胞和血清的问题，而不是简单的不分化的问题了。一般的试剂质量有问题最多导致不分化。
  但你的细胞又是同一批保种的，之前取出来都正常。所以除非细胞后续的保存出了问题，或者血清污染了支原体，你确定更换的血清也是好的？培养基是自己配制的还是买的液体？自己配制的培养基，水源有没有检测过pH正常，电阻值正常？还有一个办法是全部使用其它实验室的培养体系（当然确保他们用的东西，都是高质量的进口试剂和溶液），看看有没有问题。

• 雪花子 (2015-10-14 16:36:35)

  
  多谢楼上的兄弟回帖，看了你的建议，我又重新回顾了一下最近的实验，想再总结一下。
  昨天情绪极其低落，以至于都发的帖都难看啊。
  这学期以来，一共复苏了6瓶细胞！！！有8代的，10代的，不超过12代，我的方法是直接加10ml完全培养基（DMEM+10%CS），放培养箱4小时，观察细胞贴壁后弃去以上培养基，更换新的培养基过夜培养。2天以后再换培养基，如果长到70%就及时传代。每批细胞复苏的贴壁率不等，都还可以，最多不超过8小时，都可部分贴壁，含DMSO的培养基没有过夜培养的，复苏后再次传代时间也不超过4天，3T3L1细胞长的很快，又不能长太满，所以4天以内都可以传代了。
  这学期的培养基刚开始是自配的，血清都是HYCLONE的，包括CS和FBS，一直是同一个供货商，其他同学都用，都没有异常。
  胰酶这学期配的，但是以前我们加EDTA，这次那个配的同学不知道为什么，就没有加，所以消化时间的确有延长，以前一般消化1分钟，基本大半都下来了，现在消化时间延长到5-8分钟，但绝对没有超过10分钟，回种后细胞生长正常，过夜贴壁很好，然后如果1比5传代的话，3天以内就可以再传了，个人觉得生长速度没有改变。
  一般传2代之后种皿，一般一瓶75cm的细胞我可以种4个6孔板，细胞很够，回传比例是1比10,4天左右就可以再次种了。
  皿继续DMEM+10%CS培养到长满后2天，一般需要5-6天时间，换DMEM+10%FBS和分化试剂，第一天状态很好，细胞变圆，变大，飘的细胞很少，第2天换胰岛素的时候感觉还好，飘的少，可是到3天，飘的细胞就多了，接下来基本每况愈下，那个飘啊，就不提了，那个心情啊，一天比一天差啊……
  发现问题后，我立刻重新配胰岛素，地塞米松因为订不到新货，只能把以前用乙醇配的（第一次配置的储备液，用PBS稀释后分装，分化成功过），放在-80°，拿出来用PBS稀释后分装，IBMX夜重新配了，都是按照最开始的方案，都是最开始用的货物批号。
  同时更换了培养基，订购了迈晨公司配置的液体DMEM，设计了一大套对比实验组，基本就是4种变量：培养基，胰岛素，地塞米松，IBMX，分别有两批，旧的和新的，用排列组合的方式，一一对照，当时做的，那个疯啊。
  分化后第一天，各组没有明显不同，到第二天，发现凡是旧的培养基，细胞飘的多，当时心中狂喜，是不是培养基出了问题，结果，到了第3天，新的培养基也飘了， 4天，分化细胞少见，到了第6天， 各组差异全部消失，飘的飘，贴壁细胞也是层次不清，一塌糊涂！！这个实验只能证明我的试剂，新旧没有差异！！但是，都没有用！！哎呀，我写到这，真的想骂人啦。
  昨天订购了新的细胞，大约1周以后可以去拿（协和细胞中心），然后，找公司订了GIBCO的血清，以前GIBCO和HYCLONE的血清我都作过，差异并不大，都能分出来。现在，基本没有什么是不可以怀疑的了，只能试试看。今天有申请了HYCLONE的澳洲血清试用，这个比我现在南美血清要贵一些，看是不是可以改善啊。
  楼上说的问题，“但你的细胞又是同一批保种的，之前取出来都正常。所以除非细胞后续的保存出了问题，或者血清污染了支原体，你确定更换的血清也是好的？培养基是自己配制的还是买的液体？自己配制的培养基，水源有没有检测过pH正常，电阻值正常？还有一个办法是全部使用其它实验室的培养体系（当然确保他们用的东西，都是高质量的进口试剂和溶液），看看有没有问题。”都非常关键，在此小妹谢过啦。
  照着分析一下， 实验室细胞保存在液氮中，液氮罐不是每周补充，但没有空过，就是补充的不定期，有时候很多，有时候很少，会不会这个也影响细胞啊……疯了！！
  血清支原体污染不确定，但实验室的卫生条件一般，确实有问题，我打算购买支原体抗生素，以后这个常规加吧。
  水是中科院一个公司的， 用了快1年，全实验室都用啊，就是我出问题……再一次疯了！！！
  这几天又去公卫楼买了去离子水，北医的公卫楼的水据说是不错，2块钱一升啊，价格也不错！以后配东西用这个！
  我们的培养箱，是松下的，大家用的都没问题，就是我的细胞不成，我也不知道该不该考虑是它的问题！疯了！！！
  其他实验室的体系用起来，操作实现起来比较麻烦，到最后不行再努力吧。
  准备订购液体胰酶，自己都不敢配东西了。
  现在进展如此，疯了！疯了！！！同学都拿我当反面教材，考虑是不是要同时作2个独立的课题，这样不至于向我一样，毕业前挂掉！！！老板都不批评了，同意我随意订购昂贵的试剂！！
  有新进展，我会再说出来，现在，基本用无谓的体力劳动充实自己死掉的心。这一周，把自己所有的塑料，玻璃容器都重新超声，泡酸，清洗了一遍。
  WHAT ELSE CAN I DO?

• summerxx (2015-10-14 16:36:54)

  
  看了你这个回复，相信你迈过这道坎之后，对实验的认识会大大提高，我做课题时遇到过的问题不比你少：），scientist是要锻炼出来的。
  我给你举一个例子吧，我以前的实验室当初做3T3 L1分化，楼下一个实验室也做，有一阵子他们怎么都分化不出来，后来折腾几个月，找到原因，是因为trypsin从牛的换成了猪的。我想，不会有人想到这个问题，即使当时这个PI是国外做3T3 L1分化的鼻祖lab出来的，也没有想到过这个因素。当时他们的策略就是，不在自己实验室做实验，到我以前的实验室做实验，用我们的所有试剂，然后不断摸索和他们的试剂匹配，最后找到原因。
  所以，我建议，你找一个实验条件比较好的实验室，去做实验。你可以直接购买进口的液体培养基，血清，trypsin，PBS（除了血清外，其它这三项，买1，2瓶都不贵的）。然后用别人的培养箱，平行做实验，试一试看。最佳途径是找一个也做3T3 L1的实验室，去他们那里做，先把实验做出来再说，实验原因有时间总是可以找出来的。

• 雪花子 (2015-10-14 16:37:31)

  
  谢谢楼上的鼓励，我每天都打开这个链接，看看，再想想，再看，总之，无论如何，我必须迈过去，所以向前看，尽自己最大的力量去try，调整最佳状态去try！
  我还养着我的3T3L1,主要想对比一下以后的新细胞，今天把前脂肪细胞照了一张相，直接拿数码相机对着镜头照的，质量一般，也请大家参谋一下，看看形态什么的是否正常，个人觉得没有特别大的改变，不过，现在，没有什么事情我很自信了，呵呵。
  

  
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• summerxx (2015-10-14 16:37:50)

  
  你这细胞看上去比较小，不够肥大，我看你第一张图片，分化也还可以，但算不上高。
  年代有点久远了，我回头帮你找一个我们养过的3T3L1分化染色图片和细胞图片吧。

• 雪花子 (2015-10-14 16:38:23)

  
  这几日主要清洗器皿，订购了液体的胰酶，PBS，gibco的血清，协和还没有给消息，希望这周可以拿到细胞。
  又上ATCC看了一眼图片，细胞确实较我的饱满一些，但差异也不是很大。图片贴上来大家也能看看。
  目前怀疑有可能支原体污染，细胞房的同学比较多，管理上也比较松散，污染的可能性不小，现在只留了一瓶细胞，准备种玻片然后hoechst 33258染色看一下，如果怀疑就买一个检测支原体的kit PCR一下，确认是否为支原体污染。
  我为什么读博士，只是因为还有一点求知欲和好奇心想知道为什么！！所以，虽然这批细胞估计是没戏了，但，死也要死个明白！！！自己给自己打气，一定要坚持到底！

  
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• summerxx (2015-10-14 16:38:40)

  
  支原体污染最主要由细胞源污染和血清污染导致，其它试剂你严格灭菌，过滤，一般不会轻易引入支原体污染，交叉污染只要注意操作也很少见，不像酵母，容易空气传播交叉污染。除非你实验室环境附近有什么特殊的带来支原体污染的东西。
  要注意细胞来源污染。血清你这次用gibco的，不会有问题了，pbs也注意灭菌好，所以试剂要单独使用，不要和其他人混用。

• 雪花子 (2015-10-14 17:08:57)

  我已经从协和细胞库拿回来新的细胞株，但观察觉得状态一般，协和老师说这是复苏后第一代，所以可能需要再培养观察一下。
  我已经传代，冻存了一些， 现在种了小皿，过几天就可以分化，看分化的效果，然后再来告诉大家，只有能分出来，才是好细胞。给大家看看这张图，是协和细胞拿过来传代后第2天的效果，感觉细胞不够丰满，有些细胞轮廓不清，状态一般。
  希望和我一样在实验中遇到困难的人坚持到底！给自己打气！

  
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• misswu61 (2015-10-14 17:09:13)

  
  我也在做分化，分化率时高时低，完全可以体谅诱导等待中的焦虑心情，继续加油努力啊!

• seagate (2015-10-14 17:09:28)

  
  虽然做的不一样，我是个初进实验室的新手，两个月一直在做PCR一次也没有成功过，一起加油吧。

• caihong (2015-10-14 17:09:42)

  
  很可能是试剂的问题，我们都是每次分化之前现配。
  顺便问一下，从协和买这样一株细胞多少钱？

• 雪花子 (2015-10-14 17:10:02)

  QUOTE:

  原帖由 caihong 于 2015-10-14 17:09 发表
  
  很可能是试剂的问题，我们都是每次分化之前现配。
  顺便问一下，从协和买这样一株细胞多少钱？

  呵呵， 在我的体系里试剂应该不是问题，首先，我配的试剂曾经顺利分化达1年半之久，其次，我在今年分化出问题时所有试剂又重新配了一遍，都不成，试剂货号，配制方法全都不变。现在怀疑还是细胞出了问题。但出现问题之后，分析起来就是一个黑箱效应，只能从外面猜，看不到里面。现在仍在研究中，但结果未确定，等些时候我会再更新。
  另外，协和的细胞不贵，700元一瓶。

• vvmmoy (2015-10-14 17:10:18)

  
  我以前也做过这个细胞的分化，发现细胞开始分化后贴壁效果就比较差，会有很多细胞飘起来，严重的时候是整片细胞全部掉下来。后来每次种板前都先用明胶预包被一下，基本上在分化过程中细胞就不会飘了。

• PINK (2015-10-14 17:10:37)

  QUOTE:

  原帖由 vvmmoy 于 2015-10-14 17:10 发表
  
  我以前也做过这个细胞的分化，发现细胞开始分化后贴壁效果就比较差，会有很多细胞飘起来，严重的时候是整片细胞全部掉下来。后来每次种板前都先用明胶预包被一下，基本上在分化过程中细胞就不会飘了。 ...

  如果你买的polysine处理过的dish，还这样飘，是细胞状态不好的原因，代数过老也会导致贴壁不牢。加明胶可以帮助解决问题，但最好还是更换细胞，不然实验结果也会有出入。
  就像人们说293或者293T贴壁不牢，其实完全是误解，都是因为用的细胞代数太长了，状态不好了。

• seagate (2015-10-14 17:10:53)

  
  As my Experience, before diffirence, the 3T3-L1 has to be very dense otherwise the differenciation would be very bad. From the photo you gave in 220 of Oct, the dencity of the cell is too low to be differenciated.
  Gas!!!