十分钟自动检测34种氨基酸
氨基酸参与了很多重要的代谢过程，专家们早在上世纪中期就萌生了一个想法，即通过测定氨基酸的浓度对某些代谢疾病进行诊断。气相色谱与质谱的联用技术使定量测量生物物料中的氨基酸成为可能，而自动化分析大大提高了其分析效率。
氨基酸对于人类和动物同等重要，但由机体器官产生的量非常有限，人类的必需氨基酸通常要通过摄取食物来获得。氨基酸参与蛋白质的合成并由此满足生物一系列其他的功能需要，如络氨酸可转化为儿茶酚胺，这是一种荷尔蒙，对心脏循环系统可起到兴奋作用；谷氨酸钠则作为神经传递物质用于传导神经信息。鉴于氨基酸存在于许多代谢过程中，它们常常被用做新生儿童代谢疾病诊断的重要标记物质。其中最著名的是苯丙酮尿症（PKU）：生物机体本身不能降解苯丙氨酸，这种氨基酸在体内富集以致严重影响到人的神经发育，通过测定明显增高的苯丙氨酸浓度可对PKU疾病进行诊断。从实用的观点出发，主要是针对活体外测试特别是体液，如血液、脊椎液和尿液进行氨基酸检测。
自动化节省分析时间
为了测定生物样品中的氨基酸，通常使用市售的氨基酸分析仪，其功能原理是基于阳离子色谱交换和柱后衍生紫外检测，这些方法的缺点是分析时间过长。
图2. 带两个独立机器人手臂的双轨式Gerstel 多功能自动进样器结构图。
如今一种高效的替代方法当属具有质谱检测器的气相色谱法，该法借助于氯甲酸丙酯将氨基酸转化为挥发性的可供气相色谱分析的衍生物。“为了使方法适合高通量的分析要求，我们将样品的前处理全部实现了自动化”，Regensburg大学功能基因组学研究所代谢学Katja Dettmer 博士说，“从加入内标（IS）开始，通过衍生到进样至GC/MS系统，所有重要的步骤都是采用Gestel多功能进样器（MPS-Prep-Station）的双通道式变体完成的。通过自动化，可减少费时的手工操作并改进重现性”。这种多功能进样器具有两个彼此独立工作的进样器机器人手臂，当一个手臂开始以ml级规模通过液体注射器加入衍生试剂时，另一手臂则以μl级的注射器加入内标（IS）和必要的少量样品。除了上述硬件的特殊性之外，控制软件（Gerstel Maestro）还提供直观的操作界面，在此操作界面上可以运用鼠标将必要的样品预处理步骤方便地从命令表中调出、组合，然后令其按照Prep-Ahead-Funktion预备程序执行GC/MS 分析。
自动化样品前处理
Dettmer博士的做法如下：将生物样品例如血液、尿液加到小玻璃样品管中，用带磁性的瓶盖密封以隔绝空气，将小瓶置入多功能进样器（MPS-Prep-Station）的致冷样品室中。所有其他操作均由自动进样器自动执行。利用封闭式的瓶盖可以将小瓶转移到振荡器上根据需要搅拌、震荡、加热和冷却。依样品基体情况，采用20~50μl样品进行分析。以下步骤则由多功能进样器（MPS-Prep-Station）全自动地执行：
图3. 丙氨酸的校正曲线。
加入内标物质（20种事先用13C和15N均匀标记过的氨基酸，以及两种氘化反应的化合物的混合物）；
稀释步骤；
加入氢氧化钠溶液、作为催化剂的甲基吡啶溶液以及衍生试剂氯甲酸丙酯；
将样品于振荡器中混合；
用有机溶剂异辛烷萃取所生成的衍生物。
用异辛烷将水相中的样品萃取到上层有机相中，运用10 μl移液枪嘴分取2.5 μl 试液直接注射到气相色谱系统中。分离在Phenomenex ZB-AAA柱上进行，采用Agilent GC-6890气相色谱仪，Gerstel-Kalt（KAS）进样系统，PTV进样器，检测器为 Agilent MSD 5975，运行模式为平行扫描和SIM模式，可以针对每个氨基酸摄录两个具有特征的质谱碎片。
图4. 全脂奶样品色谱图，用同位素标记的标准氨基酸在图中以红色标出。
方法特征化和实用化
Dettmer博士运用MPS-KAS-GC/MS 对34种氨基酸和二肽进行了定量测定，定量分析利用加入一系列内标所做的工作曲线进行。内标的组成为通过13C和15N均匀标记过的氨基酸混合物，包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、丝氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、谷酰胺、赖氨酸、组氨酸、络氨酸、色氨酸、胱氨酸等。Dettmer博士说：“对于那些没有内标可用的氨基酸，需采用同位素标记的氨基酸予以校正，在下一次进行洗脱。借助于稳定同位素标记的氨基酸可以明显改进方法的重现性和校正曲线的相关系数，实验表明，分析34种氨基酸的时间要明显快于常规方式。”
当生物试液进样量为50μl时，大多数氨基酸的校正范围在 0.3~200μM 之间。检测限的范围（LOD
检测的极限值）分别如下：丙氨酸、甘氨酸或色氨酸为0.03μM，谷酰胺、脯氨酸和羟基脯氨酸为12μM。最低的定量极限（LOQ检测的极限值）为0.3~30μM。方法已经成功地用于各种生物样品的分析并测定了分析的重现性，研究了人和鼠的尿液以及血清，重复分析10次：人尿分析的相对偏差（RSD%）为2.0%~8.8%，人血清的相对偏差为0.9%~8.3%；鼠尿分析的相对偏差为1.3%~9.1%。
多种实际应用
Dettmer 博士证实：“运用此方法可以对如尿液、细胞培养液、细胞抽提液和血清等进行轻松而可靠的分析”。除了前面提到的新生婴儿代谢障碍等临床诊断应用之外，氨基酸分析在食品分析中也独具应用，实践证明，MPS-KAS-GC/MS方法可以用于诸如奶品、啤酒和果汁饮料的分析。Dettmer 博士和同事们进行了苹果汁、啤酒和酱油的实验研究。结果表明，酱油中的氨基酸含量很高，其中谷氨酸钠以47.47mM占据主导地位。苹果汁中的主要氨基酸是丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸盐和谷氨酸钠，其中天冬酰胺浓度高达3.17μM。啤酒的主要氨基酸成分则是1.13mM的甘氨酸和3.56mM的脯氨酸。
Dettmer 博士总结说：“所得结果明确显示出自动化的MPS-KAS-GC/MS方法非常适合生物基体样品中氨基酸的检测，无论是尿液、血液还是食品。”
10min内检测34种氨基酸
采用本文介绍的
，可在10min内自动检测34种氨基酸，包括丙氨酸、肌氨酸、甘氨酸、α-氨基丁酸、缬氨酸、β-氨基异丁酸、亮氨酸、别异亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、丝氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、硫代脯氨酸、天冬氨酸盐、蛋氨酸、马尿酸、羟基脯氨酸、谷氨酸钠、苯丙氨酸、α-氨基己二酸、α-氨基庚二酸、谷酰胺、鸟氨酸、甘氨酰脯氨酸、赖氨酸、组氨酸、羟基赖氨酸、络氨酸、脯氨酸-羟基脯氨酸、色氨酸、胱硫醚和胱氨酸。
