单克隆抗体腹水制备实验——杂交瘤细胞接种
| 实验方法原理 | 高滴度的单克隆抗体的制备可以通过在小鼠的腹腔内接种能产生 MAb 的杂交瘤细胞，从而产生腹水来获得。腹水可收集几次，经热灭活、滴定后储存。 |
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| 实验材料 | |
| 试剂、试剂盒 | 完全DMEM-10培养液（含10mmol／L HEPES 及1mmol／L丙酮酸钠）PBS／HBSS（无菌且不含 FCS） |
| 仪器、耗材 | 20-G／22-G注射针头18-G 注射针头175cm2组织培养瓶50ml无菌聚丙烯锥形离心管15ml无菌聚丙烯锥形离心管 |
| 实验步骤 | 1. 用 20-G 或 22-G 的注射针，往小鼠腹腔内注射降植烷，每只鼠 0.5～1 ml，1 周后接种细胞。 2. 在 175 cm2 培养瓶中加完全 DMEM - 10 / HEPES /丙酮酸钠培养液，进行杂交瘤细胞的培养，使细胞生长至对数期。 3. 将培养液转入 50 ml 锥形离心管中，室温下 500 g，离心 5 min。弃上清。 4. 细胞重悬于 50 ml 无菌的 PBS 或 HBSS （ 不含 FCS ） 中洗涤。于室温下 500 离心 5 min , 弃上清。重复 2 次，然后细胞重悬于 5 ml 的 PBS 或 HBSS 中。计数细胞，通过台盼蓝排除法确定细胞活力，细胞应该有接近 100 % 的存活力。 5. 用不含 FBS 的 HBSS 或 PBS 调整细胞浓度至 2.5 × 106 细胞/ml。用一个 10 ml 的无菌的带 22-G 针头的注射器，对裸鼠进行腹膜内注射 1 ml 细胞，同时注射 3 个裸鼠。等待腹水形成（1～2 周）。 6. 收获腹水。一只手抓住并固定小鼠，使其腹部皮肤绷紧。另一只手将一只 18-G 的针头插入小鼠腹腔 1～2 cm 深。进针部位为左下腹或右下腹，以避免刺入鼠上腹部的重要器官，以及腹中线处的主要大血管，将腹水滴入一只无菌的 15 ml 聚丙烯锥形离心管中。 7. 如果腹水出现凝块，可用一小木签沿着凝块的周围（位于凝块与管壁之间）挑一下凝块使之解体，然后再离心。凝块可能会粘在小木签上然后移走，也有可能一直在管内离心后组成沉淀。 8. 在室温下，1500 g，离心腹水 10 min, 收集上清，弃沉淀，将腹水存放于 4℃，直到收集腹水的工作完成（在 1 周内）。 9. 让小鼠再次积累腹水（2～3 天），再次收获腹水。重复这个过程直到再没有腹水产生可供收集，或者小鼠健康状况不佳。此时，可处死小鼠。 10. 把在几天内收集到的腹水汇集到一起，于 56℃ 水浴 45 min 进行热失活。如果凝块形成，可参照步骤 7 中方法去除之，然后再离心。 11. 采用适当的方法检测腹水中的 MAb 的滴度。MAb 的饱和浓度（最大活性）应该达到 0.5 % 或更高稀释度。MAb 滴度偏低的原因常为杂交瘤不稳定，从而停止产生 MAb, 或者由于杂交瘤在体内连续多次传代（2 次以上）所造成的。 12. 按大于 1:10 的比例稀释 MAb，并通过 0.45 滤膜滤过除菌。分装并冻存于 -70℃, 避免反复冻融，可冻存数年之久。如果腹水不是用来进行生物测定，那么可加入叠氮钠至 0.02 % 的终浓度。 |
| 注意事项 | 1. 在步骤 7 注射小鼠之前，检测上清中 MAb 的活性（如 ELISA），或此步骤最好在细胞扩增之前进行。 2. 为避免出现将病原体引入啮齿动物的危险，用抗体产生分析法对细胞进行病原体检测不要稍有腹水就穿刺，应等 3～7 天腹水增高时再收集以获取最多的量。每只鼠通常可收集到 5～10 ml 腹水（有时可多于 40 ml）。 3. 如果小鼠一点腹水也未产生就死亡了，特别是接种后 2 周内就死亡，那么再次进行小鼠接种时可注射少一些细胞。如果接种 2 周后小鼠不产生腹水而健康状况良好，那么再次接种时可以给这些小鼠以及那些注射了降植烷而未接种过细胞的幼鼠多注射一些细胞。如果形成实体瘤，那么可将这些实体瘤细胞制成悬液并注射接种到另一只注射过降植烷的小鼠腹腔内。即使只产生少许腹水，这些腹水都可以转移接种到另一只鼠的腹腔内（大约 0.5 ml/鼠），这样就应该会产生大量的腹水。 4. 有时腹水太多，压力太大，以致针一刺入，腹水就大量喷射出来，因此在刺入腹膜腔之前应确定针的出口确实对准了收集离心管口。 5. MAb 的饱和浓度（最大活性）应该达到 0.5％ 或更高稀释度。MAb 滴度偏低的原因常为杂交瘤不稳定，从而停止产生 MAb, 或者由于杂交瘤在体内连续多次传代（2 次以上）所造成的。 展 |
