免疫组化的经验总结（3）－操作要点和技巧
1． 固定：最好用4%的多聚甲醛固定液。对于冰冻切片，甲醛固定有时比冰冻丙酮好；但对于不同的组织和抗原，可选用不同的固定液。 有时候商品化的抗体会有比较适合而推荐的固定液，请于购置前注意说明书。
Bouin S固定液：饱和苦味酸750ml，甲醛250ml，冰醋酸50ml，其对组织的穿透力较强，固定较好，结构完整，但因偏酸，对抗原有一定损害，且组织收缩明显，不适于组织标本的长期保存。
PLP液：即高碘酸钠-赖氨酸-多聚甲醛，适于固定石蜡切片。适于富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。
2．组织脱水，透明：时间不能太长，否则在切片时容易碎片，切不完整。
3．切片时展片：有些组织在切片后难以在水中展开，这时可适当地在水中加入几滴乙醇。
4．烤片：60℃ 30分钟或37℃ 过夜，温度太高或时间太长，抗原容易丢失。
5．蜡块及切片的保存：最好在4℃保存
6．脱片问题： Poly-L-Lysine(多聚赖氨酸)为目前免疫组化染色工作中最常用的一种防脱片剂，6ml的多聚赖氨酸溶液可按1:10稀释成60ml的工作液，适合于需要酶消化、微波、高温高压的防脱片处理。如不行，可用双重处理（APES和Poly-L-Lysine）的切片。在以上两种条件都行不通的情况下，可用如下方法：切片在脱蜡前，放在APES 1：50 丙酮溶液中浸泡3分钟，晾干，即可进行下一步。
7．灭活内源性酶：HRP系统：3%双氧水灭活；AP系统：3%HAc灭活。
8．暴露抗原：对于石蜡切片的免疫组化实验时，必须采用高温加热抗原修复，这将有助于暴露抗原决定簇，从而增加免疫组化染色的强度(不同抗体的最佳修复液请参阅抗体说明书)。对于不同的组织，不同的抗原，不同的抗体，所采用的方法应不一样，可进行热修复、胰酶消化、既不修复也不消化。胶原还可以用胃蛋白酶消化等。
9．封闭：在山羊血清封闭，非特异性染色仍然较强时，可延长封闭时间或用浓缩血清封闭
10．抗体稀释：应遵循“现用现配”的原则，对于PBS稀释的抗体一定要当天使用。
11．背景高：在抗体浓度、反应时间、反应温度等合适的条件下，如果背景依旧高，可采用含1‰ Tween20的PBS洗，特别是在显色之前要多洗。
12．返蓝：在苏木素复染后，可用碱性缓冲液（如PBS）或Na2HPO4的饱和溶液返蓝。
13．显色：一定要在显微镜下观察，注意控制背景。
DAB法 显示过氧化物酶
〔原理〕 过氧化物酶分解H2O2的过程中，下面反应不直接发生：AH2（供氢体）+H2O2→A（供氢体的氧化物）+2H2O2实验可知，有称为复合物 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、的酶——底物（受氢体）复合体生成，在复合体最后分解为酶和水时，游离的原子氧使供氢体氧化而显色。酶组织化学中所使用的供氢体应是含有色原性基团的发色物质，如奈酚和联苯胺。
免疫组化染色步骤（以ABC法为例）
溶液的配置：
1. 0.1M PBS 2000ml：NaCL 18g, NaH2PO4·2H2O 0.8g,Na2HPO4·12H2O 12g. 共六份
2. 柠檬酸盐缓冲液：
贮存液：0.1M柠檬酸溶液（A）：21.01g 柠檬酸 + 1L 蒸馏水
0.1M柠檬酸三钠溶液（B）：29.41g 柠檬酸三钠 + 1L 蒸馏水
工作液：9ml A液+41ml B液+450ml 蒸馏水→0.01M柠檬酸盐缓冲液
3. 0.03% H2O2-甲醇：30% H2O2 0.4ml + 400ml 纯甲醇→充分混匀
4. 20% 甘油：80ml 纯甘油 + 320ml 蒸馏水
5. 稀释抗体：1︰300 ，1︰400 ，1︰600 （临用前配）
6. 酒精的配置
染色步骤：一步法
1. 载玻片 烤箱中 60℃ 40′。
2. 二甲苯Ⅰ，60℃ 20′(水浴箱中)，二甲苯Ⅱ，室温 15′。
3. 脱水，100%→95%→85%→75%酒精，每级均为3′。
4. 蒸馏水冲洗，PBS 5′﹡1
5. 微波炉修复抗原：0.01M 柠檬酸盐缓冲液，99℃ 肺 20′，心肾 12′
6. PBS 3′*3
7. 0.03% H2O2-甲醇，室温20′
8. PBS冲洗，PBS 3′*3，甩干或纸巾吸去多余液体（勿碰到组织），PAP Pen划境线。
9. block solution 封闭抗原，室温10′。
10. 倾出封闭液，不洗，滴加一抗（60ul），4℃过夜或37℃ 1～2h。
11. PBS冲洗，3′*3。
12. 除去PBS，滴加A增强剂，室温25′。
13. PBS冲洗，3′*3。
14. 除去PBS，滴加B剂，室温35′。
15. PBS冲洗，3′*3。同时配置DAB显色剂。
16. 除去PBS，DAB显色10′（在显微镜下观察染色程度控制染色时间）。蒸馏水冲洗。
17. 复染：苏目素均匀滴加2滴，40′′，蒸馏水冲洗，60℃温水泡半分钟。
18. 脱水：75%酒精→85%→95%→100%（3次），每级3′。
19. 透明：二甲苯Ⅰ3′，二甲苯Ⅱ3′。
18. 封片：中性树脂，加盖玻片（组织部位切勿残留小气泡），60℃0.5h烘干。
结果：棕褐色反应产物代表抗原X的定位。
拍照
1. 更换样品时，除了调整焦距和视野外，显微镜上的其他部件都不能动！所有的样品必须一次拍摄完全。特别是在拍摄过程中，不要一会用高倍镜，一会用低倍镜，来回切换物镜。
2. 数码相机必须设置为手动曝光，并且保持每张照片用同样的曝光条件，同样的曝光时间，同样的光圈。特别要注意的是，一定要将数码相机的自动白平衡功能给关掉
3. 免疫组化切片一般染色不太深，因此拍摄出的照片颜色较浅，就让它浅。拍摄出的照片中空白部位应尽可能呈现纯白色。测量其灰度应在250左右。如果呈现淡蓝色，一般是相机自动白平衡在起作用。另外一个因素是显微镜灯光电压不正确。要使灯光本身的色温正确。既不偏黄，也不偏蓝。
