细胞冻存的操作要点（四）
低温冻存技巧
冷冻凝固的过程中，水分会在0℃~-20℃区间形成不同形状的结晶
在细胞冻存时“降温速度、冰晶形成量和细胞渗透压改变程度”是冻存成功与否的重要关键。
降温速度慢：冰晶由细胞外开始形成，造成胞外渗透压变小，细胞内水份移动至细胞外造成细胞脱水。
降温速度快：水分流动时间短，细胞内外渗透压改变程度小，但大量水分留在细胞内造成大量胞内冰晶形成，使得胞器损坏。
这些都可能引起细胞损伤、凋亡或坏死，也可能造成复苏后细胞存活率低、细胞形态改变、细胞功能丧失、基因变异等现象。
由此可知，最适合的冻存条件为“在增加细胞渗透压稳定性的溶液中，以慢到能减少胞内冰晶形成，但也足够快到能预防细胞脱水的降温速度冻存细胞”。
慢冻快融
1. 慢冻→两种办法：
手动降温：将细胞依序放在4℃（30分钟）、-20℃（1小时）、-80℃（过夜）后移至液氮中保存。
程序降温盒：是一般最广泛使用的降温法，为一种特制冷冻容器，使细胞以每分钟约-1℃的速度降至-80℃（过夜），然后移至液氮中保存。
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程序降温 |
手动降温 |
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优点 |
主动监控温度 一些控制速率的冷冻机不需要任何可消耗的制冷剂 |
不需要任何特殊器皿 成本低 |
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要求 |
受控速率冻结装置 适当的存储瓶 专门的冷冻溶液 |
专门的冷冻溶液 -80℃冷冻机 液氮罐 |
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长时间保存 |
液氮或低温储存（只要低于-135℃即可） |
液氮 |
由此可以看出，程序降温精准度更高，优于手动降温。大家可以根据实验条件选择不同的冻存方式。
2. 快融：
将冻存在液氮中的细胞冻存管快速移至已37℃预热的水浴锅中（水面需低于管口，避免水分意外进入冻存管造成潜在污染），使细胞冷冻悬液迅速融化；此做法能让细胞冷冻悬液快速通过-20℃~0℃这个结晶形成温度范围，避免冰晶进入细胞形成再结晶，对细胞造成二次伤害。
FAQ
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问 题 |
建 议 |
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有毒的冷冻保存液 |
根据制造商的说明使用商业上可获得的和定义的介质。解冻后立即取出冷冻保护剂。避免细胞在室温中置于低温保护介质中。 |
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不适当的冷却速率 |
使用-1℃/min的逐渐冷却速度。要达到这个速度，可以使用保温的冷冻容器或控制速度的冷冻机。 |
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冷冻后的温度变化 |
保持细胞在-130℃后的低温。运输时要将细胞放在干冰上，并确保液氮中有充足的液氮。 |
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不当的解冻速率 |
细胞必须迅速解冻，使用37℃的水浴解冻冻存管。 |
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不正确的细胞密度 |
根据不同的细胞类型选择冻存的细胞密度。典型的细胞密度冻存密度是1-10*106cells/ml。 必要的话，要进行细胞最佳冻存密度测试。 |
Reference
1. Ultralow storage temperatures suspend all molecular processes and prevents free radical generation that negatively effects cryopreserved cultures(Baust J., 2007; Baust, Corwin, Van Buskirk, & Baust, 2015).
2. Mizrahi A, Moore GE, Appl Microbiol. 1970 Jun; 19(6):906-10 Merchant DJ, Hellman KB, Schneider H, Muirhead EE.
3. Baust J., 2007; Van Buskirk, 2007; Baust, Corwin, Van Buskirk, & Baust, 2015; Allegrucci & Young.
4. Data Acknowledgment: Prof. Shirley H.J. Mei and research team Yuan Tan and Mahmoud Salkhordeh, Regenerative Medicine Program, Ottawa Hosptoal Research Institute(Ottawa, Canada).
