水稻LEA基因组规模的鉴定与分析
实验概要
本实验鉴定了OsLEA基因，将基因定位到水稻染色上，进行了序列对比和基因转变分析，LEA基因的表达分析及启动子基序分析。
实验材料
基因组及蛋白质序列的来源：
分别从TIGR (http://www.tigr.org)和BGI (http://rise.genomics.org.cn/rice/link/download.jsp)下载Nipponbare和93-11基因组序列数据。从网站(http://cdna01.dna.affrc.go.jp/cDNA/下载32127Nipponbare全长cDNA序列。白杨基因组数据从网站(http://genome.jgi-psf.org/Poptr1/ Poptr1.home.html)下载。所有数据的处理和分析皆在IBM P650的服务器上完成，使用IBM AIX的Unix操作系统。
实验步骤
1. OsLEA基因的鉴定
使用HMMER的hmmpfam功能模块，从Pfam数据库(http://www.sanger.ac.ulc/Software/Pfam)上搜索一段己知的LEA基因序列，LEA蛋白的HMM谱将其分成七类，分别是LEA_1， LEA-2， LEA-3，LEAwe-4，LEA-5，Dehydrin和SMP。这些简图被用于在TIGR (http://www.tigr.org/tdb/e2kl/osalpseudornolecules/info.shtml)上用HMMSEARCH程序扫描日本水稻基因组的染色体。在鉴定OsLEA基因后，将基因定位到水稻染色上。另外，从KOME(http://cdna0l.dna.affrc.go. jp/cDNA/)下载水稻的32，000全长cDNA (FL-cDNA)，通过全长cDNA和OsLEA基因的比对研究OsLEA基因的可变选择性剪接。
2. 序列对比和基因转变分析
用CLUSTAL X (V 1.81)程序在默认设置下完成预测OsLEA基因多序列比对。人工去除不保守区域。用GENECONV程序进行基因转换检验，计算出全局和成对P值来估计被观察片断长度的统计显著性。
3. LEA基因的表达分析
通过生物信息和实验的方法研究OsLEA基因的表达。在生物信息方法的分析中，我们从TIGR Plant Transcript Assemblies (http://plantta.tigr.orgo)上选用BLASTN比对，取匹配率大于95%，检索到OsLEA基因的FL-cDNA序列和EST序列。另外，从NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.，gov/geo/)上的GEO下载了两组水稻基因芯片数据来检验OsLEA基因的表达情况。其中一组为GSE661，含有ABA处理和GA处理的GSM9853，GSM9854，GSM9855，GSM9857，GSM9858，GSM9859和GSM9860。另一组是GSE2415，在幼苗时期经过FS，FD，Dr，Os，渗透和冷害。
在实验分析中，用半定量RT-PCR检测用ABA或胁迫处理的一些OsLEA基因的表达情况。在温室中用水培法种植粳稻的日本睛品种。在播种40天后分别用15%(v/v)PEG6000，0.1mM ABA和200mM NaCl处理六小时。未经处理的幼苗作为对照。利用Trizol试剂盒，按照手册的说明和Dnase处理，从对照和处理的幼苗地上部分提取总RNA。从总RNA合成cDNA第一链并做为sqRT PCR的模板。SqRT PCR的过程为：95℃ 5min，接着是95℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s，82℃ 5min循环32次，最后72℃延伸5mino OsLEA基因使用的扩增引物如表2所示。此外，在sqRT-PCR中使用肌动蛋白基因作为对照，以确保每次反应中消耗等量的cDNA。肌动蛋白基因使用的引物为5'-GGAACTGGTATGGTCAAGGC-3’和5'-AGTCTCATGGATACCCGCAG-3’。
4. 启动子基序分析
基于微阵列数据，OsLEA基因被分成受ABA处理或干旱处理诱导表达和无诱导表达两组。检验诱导调控和非诱导调控的两组基因，每个OsLEA基因利用全长cDNA来确定5’端上游1，00bp序列，从而来确定受ABA或干旱诱导的保守序列(顺式作用元件)。用ELPH (http://www.cbcb.umd.edu/software/ELPH)程序的Gibbs取样方法的默认参数设置来获得保守序列。使用WebLogo程序将确定的基序按照它们在区域中的位置和它们的一致顺序来划分。
