操纵基因和调节基因的鉴别
野生型的操纵子以被调节的方式进行表达,调节系统若发生突变可能使表达停止或者在没有诱导物存在时仍然表达。前者称为不可诱导性(uninducible)突变;后者对调节没有反应能力,无论诱导物是否存在都进行表达,故称为组成型突变(constitutive mutants)。
操纵子调节系统的成份通过突变已被鉴别出来,它们作用于结构基因的表达以及编码区的外侧序列。这些成份分为二类:以启动子和操纵子,作为调节蛋白(RAN聚合酶,阻遏物)靶顺序的通过顺式作用突变而被鉴定出来。lac位点通过反式作用突变被鉴定是为编码阻遏蛋白的基因。
操纵基因是原来通过组成型突变鉴别出的,称为“Oc”,其分布特点提供了第一个顺式元件的证据,它是有功能的,但本身不编码。与OC突变相邻接的结构基因以组成型表达,这是由于突变改变了操纵基因,使阻遏蛋白不能与之结合。这样阻遏蛋白就不能阻止RNA聚合酶起始转录。从而使操纵子持续转录。
操纵基因只控制与它相邻接的一些lac基因。若将第二个Lac操纵子导入细菌的质粒上,它有自己特有的操纵基因。操纵基因互不干扰。因此如果一个操纵子有一个野生型的操纵基因,在通常条件下,它将被阻遏。当第二个操纵子带有OC突变时,它将持续表达。
这些特点表明操纵基因是一个典型的顺式作用位点。操纵基因只控制与其相邻接的基因而不影响存在于细胞中的其它DNA上的等位座位。像OC这样的突变称为顺式-显性(cis-dominant)。顺式作用位点中发生突变就不能和相关蛋白相结合,当两个顺式作用位点彼此靠得很近时(如启动子和操纵基因),我们通过互补测验是不能分别突变发生在那一个位点上,而只有通过它们对表型的影响来加以区别。顺式显性是控制邻接顺序的那些DNA位点的特性。如果一个控制位点其功能是作为多顺反子mRNA的一部分。它将表现出顺式显性的特点。特别表现在控制位点不能和被它调节的基因相分离。从遗传学的观点来看这些位点和基因是在DNA上还是在RNA这并不重要。
lacI-突变型也可导致持续转录。无论是点突变还是缺失都可产生这样的结果。后者可能是丢失了和DNA结合的功能区。因此与诱导物是否存在无关。这种现象是符合负控制系统的。lac+基因编码一个阻遏蛋白,它可以关闭lacZYA的转录。阻遏蛋白失去和操纵基因结合能力时,则为组成型突变。转录能在启动子上自由地起始。同时lacI- 突变由于阻遏蛋白的失活使lacZYA呈组成型表达。
当lacI- 和lacI+二者同时存在于同一个细胞时,通过确定二者的关系可以帮助人们得出正确的结论。这只能通过构建部分二倍体(partial diploid)来完成的。即一个拷贝的操纵子位于细胞的主染色体上,而另一个放在质粒上,此质粒仅带少量基因,可以独立复制。
在细胞中若既有lacI+又有lacI-,则可以正常调节。当除去诱导物时,结构基因又重新被阻遏。这表明lacI+可以产正常的阻遏物,当诱导物不存在时它可以反式阻遏lacI ZYA+基因,按遗传学的观点野生型的可诱导性对于组成型突变型是显性的。这是负控制的重要标志。
操纵子非诱导性突变不能都得到表达,它们可以分成两种组成型突变:(1) 启动子突变是顺式作用,若这种突变阻碍了RNA聚合酶与Plac的结合,也就不能阅读操纵子,因为它不能转录。(2) lacI突变若阻遏物失去和诱导物结合的能力也会导致和前者相同的现象。这种突变称为lacIs。
这种反式作用对野生型来说是显性的。阻遏蛋白被保持在对操纵基因的识别和阻碍转录的这种活性状态中。诱导物是否加入对其没有影响。这是由于细胞中突变的阻遏物结合在所有的lac操纵基因上并阻断转录,同时还不能取下,野生型阻遏物的存对它也毫无影响。
lacI突变的特点可以从阻遏蛋白结构的得以解释。在阻遏蛋白上具有两种不同类型的结合位点。通过这些结合位点来控制基因的表达以对环境作为反应。DNA-结合识别操纵基因。诱导结合位点与小分子诱导物结合。一旦与诱导物作用使其构象发生改变而失去与操纵基因DNA结合的能力。通过lacI突变失去某些活性可以鉴别出阻遏物亚基中的两个结合位点。DNA-结合位点的突变是组成型的(因为阻遏物不能和DNA结合来阻断转录)。诱导物结合位点的突变是不可诱导性的(由于诱导物不能减少阻遏物和DNA的亲和力)。
阻遏物功能的一个重要的特点是多聚体蛋白。在细胞中阻遏蛋白的亚基随机结合成四聚体。当不同的lacI等位基因存在时,它们的产物作为亚基结合成异聚四聚体,其特性和同聚四聚体不同。这种亚基之间的作用类型是具有多聚体蛋白的性质,被称为等位基因间的互补(interallelic complementation)。
负的互补(negative complementation)发生在某些阻遏蛋白突变体之间。正如在lacI-d与lacI+基因的重组中所见到的一样。此lacI-d的突变仅导致阻遏蛋白不能和操纵基因结合。因此它像lacI-等位基因一样,使操纵子呈组成型表达。由于lacI-类型的突变产生的阻遏物没有活性,它相对于野生型基因是隐性的,而“-d”这个符号表示负互补这种突变类型是显性的。这种突变称反式显性(trans-dominant),也称为显性失活(dominant negatives)。
这种显性的原因是由于lacI-d等位基因产生一个“坏”的亚基不仅它本身不能结合操纵基因的DNA,而且它还通作为四聚体的一部分阻止四聚体中“好”的亚基与DNA结合。这就意味着阻遏蛋白四聚体是作为一个总体,而不是单个单体的简单的集合。这对完成阻遏来说是很必要的。在体外将“好”的亚基和“坏”的亚基混合起来也会产生损坏的作用。
lacI-d的突变是发生在阻遏蛋白的DNA结合位点这就可以解释混合的四聚体可以阻止与操纵基因的结合。结合位点数目的减少使四聚体和操纵基因的亲和力减少。lacI基因的左末端对于蛋白产物来说正好是在N-末端DNA-结合位点。lacI-隐性突变发生在此位点以外的任何区域。但可以起到DNA结合的间接作用。
lacIs是不可诱导性突变,它是不能对诱导物作出反应。此可能由于阻遏蛋白失去了诱导物结合位点,或者不能将它们的作用传递到DNA-结合位点。lacIS突变位点是很有规律的延着基因成束间隔排列。这些间隔可能存在着肽链的改变。
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R P O Z Y A
①Z、Y、A是指结构基因,用于表达性状;
lacZ编码β-半乳糖苷酶,它可以切断乳糖的半乳糖苷键,而产生半乳糖和葡萄糖;
lacY编码β-半乳糖苷透性酶,它构成转运系统,将半乳糖苷运入到细胞中;
lacA编码β-半乳糖苷乙酰转移酶,只将乙酰-辅酶A上的乙酰基转移到β-半乳糖苷上;
②I是指调节基因,调节分泌阻遏物或诱导物;
③O是指操纵基因,与阻遏蛋白的结合部位;
④P是指启动子,启动基因的转录和翻译。
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