克隆经验—帮助新手快速做出克隆-5
1. 连接产物10μL、5×KCM溶液10μL、双蒸水30μL，（共50μL）混匀，置冰上。
2. 从-70℃冰箱中取 1支感受态细胞，置冰上。融化后立即取50μL，加入步骤1中的混合液中，轻轻吹打数次混匀（不可用力过大，不可涡旋）， 立即置冰上。
3. 冰上放置20 分钟。
4. 室温放置10分钟。
5. 加入500μL新鲜LB， 150转37 ℃ 1小时。
6. 6000转/分 5分钟离心收菌。留150μL上清（其余上清丢弃），吹打数次，重悬菌体。
7. 涂板。 37 ℃ 孵箱过夜。
（提示：可使用质粒转化该感受态细菌，检验转化效率。1μL的质粒转化，DH5α菌板满板不可计数；BL21菌板有200－300个菌落。）
小结：
本方法采用简洁的步骤。最有特点的地方是片断回收后收到一个试管中，而不象一般的操作分别收到不同的试管中，回收后再电泳定量，并计算大小片断的比例，最后配置连接体系。
这种简洁的步骤不仅提高效率、避免引入人为的误差（例如肉眼对DNA的定量的误差），还减少了DNA的损失，保证了更多的DNA（实际上是全部的 DNA）进入下面的连接反应。
所以本方法的第一个优点，是保证连接和转化中，有“足够量”的核酸。 连接和转化的核酸量得到保证，克隆 成功就得到保证。
例如本方法中，制作大片断的A质粒取3μL，对于通常的小提质粒，3μL意味者600－1800ng的DNA。一般认为大片段的适当范围是
50－200ng/10μL连接反应。本方法即使在回收过程中损失一半，仍然剩300－900ng。实际上，使用本方法，在片断平移的克隆
中，如果把转化的菌液全部涂板，得到的克隆 多得不可计数；片断平移克隆 实际上只取一半转化菌涂板即可。 PCR接入载体的克隆
效率没有那么高，但是一般也达到40－60转化子/平板。
本方法的另一优点，是这些看起来固定的步骤，例如酶切、酶连、以及转化等方案，实际上已经遵循了很多原则，而且这些步骤之间互相平衡，组成一个很稳定和可操作性很强的系统。
例如起始酶切A质粒和B质粒的量——3μL：7μL，已经隐含了载体：插入片断＝1：2~3的比例（PCR克隆
经折算后大概是1：5~10）。即使加上DNA回收中会损失、大片断和小片断回收效率不同、酶切质粒同酶切PCR效率不同等影响因素，最后回收在试管中的大小片断比例仍然可以落在一个合适的范围内。
酶切使用的酶量，是经过计算的。可以保证是采用3－5倍的量切割质粒或PCR片断，因此可以保证酶切反应的效率。
连接反应在4℃下可以达到最大的转化率。实际上对于大多数粘端突出3碱基的酶切位点，18 ℃ 3小时已经足够。
Nucleic Acid Research上登载的感受态菌制备方法，可以得到效果很稳定的感受态细胞。每微克DNA可获得10的八次方个转化子。
因此，这套方法考虑到了克隆 的每个重要环节，并以可靠的手段将这些环节“固定”下来。这套方法对于操作者和试剂带来的波动也有很好的“容错”能力，或者说，它的系统冗余比较大，保证了这套方法极高的成功率。
