细胞转染需要注意的几个问题-3
转染方案
一般原则：建立一套适当的转染方案；首先从一种标准方案开始，然后通过改变试剂/DNA的配比和复合物的剂量进行优化。
转染复合物的制备——诸如转染试剂/DNA配比，离子强度，缓冲液pH值，以及温度等变量都会影响到转染复合物的组成和功能。质粒可用无菌水或TE
缓冲液稀释。如果您要使用一种市售的转染试剂，就应当仔细阅读该试剂所提供的使用说明。在不含血清或其他蛋白的培养基中制备转染复合物；如果制备复合物所使用的培养基含有血清，它就会对转染产生抑制。制备转染复合物的最佳孵育时间是一个非常关键的环节，对于不同的转染试剂而言可能差别很大。
转染试剂/DNA配比（负载比）——所有的转染试剂都会在某一个试剂/DNA配比时最为有效。有时候这种最佳配比的所在范围非常狭窄；而且对于每种实验体系都必须进行优化才能得到最佳配比。
形成转染复合物所用的稀释剂——对于多数试剂而言，很关键的一点是要使转染复合物能在普通基础培养基或盐溶液中形成。
转染复合物的加入——有两种替换方法可用来将转染复合物加入转染细胞：1.将复合物浓缩液逐滴加入培养基，或者2.将转染复合物先用培养基稀释，然后进行培养基更换操作。第一种方法更简便，而第二种方法则更因为避免了试剂在局部浓聚而产生毒性，所以会使结果的一致性更好。
时间进度
一般原则提示：要确保最终结果的成功；建立一个合适的时间进度进行转染实验以保证您所需要的目的蛋白能得到最佳表达。
转染的开始——在转染前12小时，将细胞分种于培养板中。在细胞达到50-80%的融合率时开始转染，这样就可以使它们在实验结束时达到接近 100%的融合。细胞对转染复合物的摄取通常在0.5-6小时的时间内完成。在这段时间后，就不会再发现转染效率有所增长。
培养基更换——某些转染试剂在摄取阶段之后需要更换培养基。如果转染必须在没有胎牛血清存在的条件下进行，那么这一步骤就必不可少。而对于可在血清存在的情况下使用的无毒性转染试剂时，如果有足够的培养基用于后续表达阶段，就可以省略这一步。如果将转染复合物留在培养基中直到进行检测，那么对有些细胞系而言转染效率会有所提高，而另外一些细胞在转染开始几个小时之后其转染效率就不会再有升高。虽然在转染步骤之后转染试剂/DNA复合物通常不一定要从培养体系中清除，但在此后的长期生长阶段换用新鲜的培养基却是必须的。如果转染细胞需要生长3-7天，换培养基就尤其重要，这样一来就使它们有时间达到最高的蛋白表达量。
时间测定——转染开始后的24-48小时内，报告基因产物的浓度逐渐增加；而这种增加取决于增强子的强度、表达外源蛋白中所涉及的细胞反应，存活细胞的健康状态，以及营养因素等。在转染后等待3-7天收集蛋白进行纯化较为常见了。
最后就是平时可能会忽略的转染试剂本身的脱靶效应off-target effect，转染试剂本身对基因表达水平（高表达或低表达）的影响，有时候可能会造成假阳性的结果。
我自己的体会是，一般的细胞，用脂质体2000和fugeneHD转染效率相差不大，虽然最近有文献说脂质体2000脱靶效应很高，但国内在乎的人貌似不多；但是干细胞，原代细胞和肿瘤细胞等一些比较难转的细胞系，Fugene
HD比较温和，细胞毒性很低，转染效率明显要好；悬浮细胞，各有千秋，不敢说一定可以，重在尝试，要是都不行，就电转吧。
