体外诊断产品相关原材料（一） -2
除了完整的抗体蛋白之外，抗体的功能性片段也被广泛应用于疾病检测领域。抗体的功能性片段是指经过特定的蛋白酶酶切之后获得的功能性片段。抗体FC段由于具有抗原性，可被其他抗体所识别，如小鼠单克隆抗体可被类风湿因子、HAMA等异嗜性抗体所识别，从而影响检测结果。因此目前在体外诊断领域中去除抗体FC段的主要目的是去除异嗜性抗体引起的非特异性反应。常用的功能性片段有Fab（由木瓜蛋白酶酶切而得）和F(ab’)2（由胃蛋白酶酶切而得）。
由于动物源性的抗体在疾病诊断应用中往往会受到不同种异嗜性抗体的影响，因此在未来，嵌合抗体（人源化）、基因工程重组抗体将会成为抗体发展的主要趋势。嵌合抗体是将不同物种的抗体片段进行组合后获得的改造抗体，如将小鼠抗体的FC片段替换为人抗体FC片段，这样便可以免除HAMA的影响。重组抗体是通过经免疫淋巴细胞而提取的抗体轻链和重链基因片段（mRNA），经逆转录后导入基因工程载体，然后进行体外表达。该方法获得的抗体，在产量、生产周期和多样性等方面相比于传统的杂交瘤方法均有明显优势。此外，该方法还可以跳过免疫系统，在不经过免疫动物的情况下直接获得特定的抗体。关于单克隆抗体，多克隆抗体和重组抗体的对比如下表。
在疾病诊断领域，抗体是体外诊断试剂的核心原料。根据技术平台和检测方法的不同，应用也略有不同。目前主要的应用平台有放射免疫分析、酶联免疫分析、化学发光免疫分析、胶体金侧向层析、荧光免疫侧向层析、免疫比浊、蛋白免疫印迹、免疫组化和直接酶联免疫分析等。在不同平台中，抗体通过修饰偶联于不同的标记物和固相介质。其中，抗体与标记物组成的偶联物称为检测系统（产生信号），而抗体与固相介质的偶联物则称为分离系统。这两个系统最终形成了完整的体外诊断免疫学试剂。关于标记物，目前常用的有放射性同位素标记、酶标记（辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶等）、直接荧光标记、时间分辨荧光标记、直接化学发光（吖啶酯）、生物发光标记、电化学发光标记、磷光标记、微球标记、链霉亲和素-生物素标记等。关于固相介质，目前主要应用的有聚苯乙烯微孔板、玻璃/聚苯乙烯乳胶微球、磁微粒、硝酸纤维膜等。
关于偶联的方法，主要有静电吸附、生物偶联（链霉亲和素-生物素、二抗、ProteinA/G等）和化学偶联。在主要的三种偶联方法中，最重要的是化学偶联。主要原理是通过将抗体分子中的活性基团与偶联物的活性功能基团通过化学反应进行交联，因此制备工艺和反应途径会对抗体活性乃至整个试剂的性能产生重要的影响。目前应用的主要活性基团有氨基、巯基、羧基和糖基等。针对于蛋白质，主要的交联反应有过碘酸钠法、同型双功能交联剂法、异型双功能交联剂法等。而针对于半抗原等小分子，主要交联方法有碳二亚胺法、碳二亚胺-NHS法、混合酸酐法和曼尼希反应等。关于不同交联方法的具体反应原理，可参考相关书籍，这里不再赘述。
在不同的检测方法中，抗体起到了多种关键的功能作用。目前常用的检测方法有双抗体夹心法、双抗原夹心法、间接法、抗体竞争法、抗原竞争法和捕获法等。在双抗体夹心法中，待测物为抗原（蛋白质和多肽为主），捕获抗体和检测抗体分别与固相介质和标记物偶联，通过与抗原形成三明治免疫复合物从而实现对抗原的检测；在双抗原夹心法中，待测物为抗体，因此抗体在试剂盒中扮演的角色为校准品或质控品，不同抗原分别与固相介质和标记物偶联，通过与待测抗体形成三明治免疫复合物从而实现对抗体的检测；在间接法中，待测物为抗体，抗原与固相介质进行偶联对待测抗体进行捕获，抗人IgG特异性抗体作为检测抗体；在抗原竞争法中，待测物为抗原（通常是小分子抗原，主要原因在于小分子上至多只有一个抗原决定簇，因此不能形成夹心复合物），捕获抗体与固相介质偶联，抗原和待测抗原竞争性地被捕获抗体捕获，从而实现对抗原的检测；在抗体竞争法中，待测物为抗体，抗原与固相介质偶联，抗体与标记物偶联，与待测抗体竞争性地与捕获抗原反应，从而实现对抗体的检测，同时，抗体还可作为校准品和质控品；在捕获法中，待测物为IgM抗体，抗IgM抗体作为捕获抗体与固相介质偶联，IgM对应的抗原的特异性抗体作为检测抗体与标记物偶联，通过形成抗IgM抗体-IgM-IgM抗原-抗IgM抗原特异性抗体的复合物对待测IgM进行检测。除上述的经典免疫学检测方法外，免疫比浊法也是目前体外诊断行业中应用非常广泛的方法。该方法中，抗体与胶乳微球进行偶联，当待测物中有抗原存在时，会引起胶乳溶液的浊度变化，从而实现对抗原的检测。关于不同检测方法的详细原理，这里不再赘述，可参考其他相关书籍。
除上述的常见方法外，蛋白免疫印迹、免疫组化和直接酶联免疫分析在科研领域应用广泛，在体外诊断领域也有一定程度的应用。其中抗体作为检测抗体可直接与待测抗原反应。
如前所述，作为主要的核心原材料，抗体对于整个免疫检测分析系统有着至关重要的影响。因此除去试剂制备工艺外，抗体自身的性能可在很大程度上决定着检测试剂的质量。目前，衡量抗体质量的技术指标仍然没有统一标准，但是可以大概总结为活性/效价/亲和力、线性范围、特异性、纯度、重复性/批间差和稳定性等。
活性/效价/亲和力，是反应抗体与抗原之间反应性的直接指标，但是目前关于该指标的测定没有标准和统一方法。现阶段，大多数抗体供应商对于效价的检测是在ELISA平台上通过重组或者天然抗原对抗体进行测试，通过信号值对抗体的活性进行考察。检测方法以直接ELISA为主，即抗原包被于聚苯乙烯微孔板后，用标记的抗体直接与抗原进行反应。这里值得注意的是，并不是高亲和力的抗体就一定对应为高性能的免疫检测分析系统。针对不同种类的标志物，对于亲和力的要求有一定区别，具体讨论将在线性指标中详细展开讨论。
线性范围是指分析方法在给定范围内获取与样品中待测物浓度成正比的试验结果的能力。该指标是反映分析方法检测范围和准确性的直接指标。线性范围的测试是在抗体配对组成基本的免疫检测分析系统后进行的，因此可以理解为是抗体性能的间接指标。正如前文所述，高亲和力抗体并不代表高性能试剂，针对不同种类的标志物，对于亲和力的需求有一定差异。当待测标志物在外周循环中存在的浓度范围很宽时，如果使用了高亲和力的抗体，那么会导至钩状效应的过早出现（钩状效应或HOOK效应，是指由于抗原抗体比例不合适而导至假阴性的现象，产生的主要原因是当抗体亲和力很强，同时抗原浓度很高时，可用抗体全部被抗原中和，导至了反应提前进入平台期甚至信号下降。），从而严重影响到了试剂盒的线性范围，导至了高浓度样本被严重低估，甚至可能导至医疗事故的产生。典型的宽浓度范围的标志物，如人绒毛膜促性腺激素(hCG)、肌红蛋白(MYO)和C反应蛋白（CRP）等。但是对于微量存在即可提示某种疾病的且浓度范围并不是很宽的标志物而言，高亲和力的抗体便显得尤为重要，因为低值样本的检出能力或称为灵敏度直接与抗体亲和力挂钩。典型的低浓度具有重要意义的标志物，如肌钙蛋白（TnI，目前市场上已经有超敏肌钙蛋白检测试剂了）和降钙素原（PCT）等，均对试剂灵敏度有很高要求。
特异性指抗体单一性识别某种特定抗原的能力。该指标虽然不直接影响试剂整体反应性，但是却对于检测结果有着很重要的影响。外周循环中除了待测标志物之外，还存在许多其他分子。这些分子可能和待测物具有类似的结构或构象；也可能与待测物存在共同的氨基酸片段。而抗体所识别的位点主要分为线性表位和构象表位。当抗体所识别的线性表位的氨基酸序列或者构象表位的结构域存在于其他分子中时，便会导至测试结果的假阳性或者假阴性。这既是抗体特异性差所导至的结果，也可以理解为抗体识别的抗原表位不够专一所致。不同分子间具有相同的抗原表位往往见于同源蛋白中，如心肌肌钙蛋白和骨骼肌肌钙蛋白直接存在多段相同的氨基酸序列；促甲状腺激素、促卵泡生成激素、促黄体生成激素和人绒毛膜促性腺激素存在共同的α亚基等。肌红蛋白与血红蛋白均具有血红素核心、地高辛和洋地黄毒苷具有类似的糖苷结构、糖抗原CA50和CA19-9均有Lewis-A糖抗原等。因此，抗体的识别位点是决定抗原特异性的关键性因素。
关于纯度，在体外诊断试剂制备过程中，往往需要先将抗体进行修饰，当抗体纯度不够时，会导至其他杂蛋白被一起偶联于固相介质或者标记物上，从而影响了试剂的反应性能，如特异性、反应信号、背景值等。抗体的纯度通常由细胞培养工艺和抗体纯化工艺所决定。使用无血清培养基可以很大程度上去除血清培养基中带来的杂质蛋白，而稳定精密的蛋白质纯化工艺则可以进一步将抗体中绝大多数杂质去除。目前，抗体的纯度测定主要有SDS-PAGE电泳后的条带扫描和HPLC测试等。值得一提的是，目前国内抗体生产厂家普遍存在的批间差问题，可以尝试从细胞培养和蛋白质纯化控制方面着手改善。
重复性/批间差，是指每批次产品的可重复性。之前所述的一系列抗体性能对于体外诊断试剂的性能有直接影响，而重复性则是保证体外诊断试剂降低批间差异并且稳定生产的前提条件。另外，如前所述，重复性和生产工艺密切挂钩，因此也是体现抗体质量的关键指标。
稳定性是指在特定的储存条件下，一定时间内抗体保持其活性的能力。值得注意的是，这里所指出的稳定性仅代表抗体在进行修饰/偶联之前的稳定性。抗体在进行修饰后，结构会根据工艺的不同产生的不同的变化，而后续的稳定性也很程度上取决于制备工艺，在制备成半成品试剂之后的稳定性并不能代表抗体的真实稳定性。抗体的保存条件对于抗体的稳定性至关重要，目前多数供应商提供的抗体的储存条件为4或-20℃；常规抗体的稀释液大多数为不含有其他蛋白和保护剂的缓冲液（抗体中若含有其他蛋白或者保护剂，会影响抗体的后续偶联）。关于37℃下的加速稳定性，目前大多数体外诊断生产公司倾向于使用37℃的加速破坏试验以模拟抗体的长期稳定性。其原理主要基于阿伦尼乌斯的经验公式推理而得，但是实际上加速稳定性并不能体现抗体的真实稳定性，其参考意义并不大。
随着我国体外诊断行业的迅速发展，相应的抗体产业也在迅速增长。但是由于我国相关行业起步较晚，因此国内抗体制造行业依然处于相对落后的阶段。现阶段，国内大多数免疫检测试剂依然以使用进口原料为主。目前主要的抗原抗体进口厂商有HyTest、Medix、Meridian和Biospacific等，这些公司均有着数十年的发展历史，对于抗体的研发生产和质量管理均有着系统化的控制。国内著名的原料生产企业有菲鹏等。随着中国体外诊断试剂行业的不断发展，中国市场越来越受到国际原料厂商的重视，可以说，除了少数因ZL或特供限制不能商品化销售的原料外，国内IVD厂家与国际巨头在原料的获取渠道上已没有明显差距。
抗体的质量控制是保证体外诊断试剂质量的重要环节。目前，关于抗体质量控制尚没有国际公认的检验标准。不同的原料生产厂商的出厂检验也略有差异。其中，主要的检验指标有外观、纯度、浓度、分子量、活性、等电点等。此外，除上述常见的质检参数外，根据用户需求不同，可能会进行更多特殊的检测，如手性测试、质谱和糖谱测试等，这里不再赘述。
关于外观，一般情况下纯化后且没有杂质的单抗通过肉眼观察基本为均一澄清的溶液。而纯化工艺出现问题，导至蛋白质变性等则会引起溶液浑浊、蛋白质聚集沉淀等现象的产生。部分特殊抗体或者多抗可能不可避免地会出现轻微的沉淀或者浑浊，供应商一般会加以说明。此外，抗体冻干粉基本为白色粉末。关于纯度，如前所述是抗体重要的性能指标。目前的检测方法基本为SDS-PAGE电泳后的条带扫描和HPLC检测。理论上，抗体纯度越高，其偶联效率和活性就越高。对于不同生产批次抗体的纯度控制，是体现产品质量非常重要的一环。关于浓度，抗体的浓度对于抗体偶联具有重要的指导意义，是计算交联剂分子比例的关键参数。主要测定方法为Lowry法和OD280nm光吸收法等。目前，对于浓度的控制并没有严格要求，每次纯化后所获得浓度差异属于正常现象。针对目前大多数的抗体偶联工艺，浓度高于2mg/mL可基本满足要求。另外，若抗体浓度过低可以通过透析或者超滤进行浓缩；若浓度过高则可以用缓冲液进行稀释。关于分子量，目前体外诊断试剂所使用的抗体主要为IgG抗体，通过还原性SDS-PAGE电泳可以看到重链和轻链的电泳条带，从而根据其位置判断重链轻链的分子量。理论上，IgG重链的分子量约为55 KD左右，轻链约为25 KD左右，不同IgG之间可能会存在细微差异。若分子量差异较大，则提示抗体构象可能遭到了破坏。关于活性，对每一批生产出的抗体进行活性测试，是反映批间差异最直接的指标。细胞株保存、传代、培养、纯化工艺的过程控制，都会对抗体活性产生重要影响。因此活性差异的控制可以理解为是抗体质量控制的核心环节。目前，关于抗体活性测试的方法，主要是通过抗原与抗体反应的信号值来进行判断，反应平台以ELISA为主。关于等电点，在抗体偶联时，pH值是影响偶联反应的重要参数，而pH设定的依据则是根据抗体等电点。一般情况，在没有经过任何特殊修饰的情况下，不同抗体等电点差异不大。另外，随着蛋白质保存时间的推移，等电点可能会出现一定程度的偏移，因此等电点的测试对于质量控制并非关键性因素。
上述讨论内容为目前原料供应商对于原料的质控参数，而对于生产过程的控制则是获得理想质控参数的前提条件。根据抗体整个生产流程，可以将过程控制分为原料质量控制、细胞库质量控制和生产纯化质量控制三个环节。首先，高质量的原料是获得高质量产品的保障，其中包括对于动物源品质的控制、培养基质量的控制、生物安全性检测等。由于行业竞争激烈，目前部分生产厂商为了压缩生产成本从而降低了原料的质量控制，这也是我国目前抗体生产行业质量参差不齐的重要因素。其次关于细胞库质量控制，细胞库的系统化管理、合理的细胞储存、传代、培养是保证高质量抗体的前提。杂交瘤细胞在数次传代后会出现活力逐步下降现象，当细胞活力不足时会导至所生产的抗体活性大打折扣。另外，若细胞株保存不善受到污染，将会造成不可设想的严重后果。因此细胞株科学的保存、复苏及传代是非常必要的。关于生产和纯化，目前单克隆抗体的生产方式主要分为体内培养和体外培养两种。体内培养是通过小鼠腹水培养而得，而体外培养则是通过生物反应器而得。两种培养方式均对原料有着很高的要求，同时，在培养过程中细胞培养工艺的控制也十分重要。值得一提的是，由于动物保护问题和动物个体间的潜在差异，在未来体外培养生产抗体可能会成为主要的生产方式。在获得培养产物后（体内培养为小鼠腹水、体外培养为悬浮培养液），通过一定的纯化步骤便可获得最终的抗体。目前纯化方式主要为亲和层析和离子交换层析，对于单抗而言，主要以protein A/G 的亲和层析为主；而对于多抗，则以高纯度的抗原亲和层析为主。为进一步获得更高纯度的抗体，则可以选择在亲和层析之前进行离子交换层析。在纯化过程中，保证各项参数和原料的稳定是降低纯化后抗体的批间差的重要因素。此外，不同抗体在使用同样纯化工艺纯化时，所得的产物可能会出质量差异。因此，对于不同的抗体选择针对性的纯化方式是非常重要且必须的。
抗体经过出厂质检合格并到达体外诊断试剂生产商手中后，根据我国体外诊断试剂生产及质量控制技术的指导原则，需要对抗体进行入库检定。一般情况下，质检的指标主要包括：外观——肉眼观察，大部分生物原料为澄清均一的液体，不含异物、浑浊或摇不散的沉淀或颗粒；或为白色粉末且不含有其他杂质；特殊抗体应具备相应外观标准。纯度和分子量——主要方法是SDS-PAGE电泳后经考马斯亮蓝或者银染色法进行染色，然后对条带进行扫描分析。此外，高效液相层析也可以用于纯度和分子量测定。蛋白浓度——主要测定方法为Lowry法、OD280nm光吸收法和双缩脲法等。需要注意的是，不同方法学之间的结果存在一定差异，因此建议可以采取与原料厂商一致的方法进行验证。效价——一般在相应试剂平台上通过待测抗原进行测定。功能性——除上述抗体固有的性质之外，功能性结果可以直接反应该原料用于实际生产的效果。一般考查使用该原料的试剂的灵敏度、特异性、稳定性以及和上一批的平行对照等。这里值得指出的是，为了更严谨地对抗体批间差异进行验证，对于合格抗体的留样是非常有必要的。此外，还可根据实际情况定制或修改相应的其他功能性质检标准。
最后，关于抗体性能和质量与试剂性能和质量的关系。好的抗体是能做出好的试剂的前提，高品质抗体在最适的试剂制备条件下能够发挥出最佳性能。但是抗体在经过修饰偶联后形成最终的免疫检测分析系统则需要经过多种复杂工艺，其中任何一环的变化都会对最终的试剂性能产生影响。目前，我国体外诊断行业处于快速发展阶段，大量试剂质量已臻完善，但仍有许多项目或平台的制备工艺需不断优化及验证。抗体与试剂制备工艺在优秀的诊断试剂体系中相辅相成，对特定工艺而言，公认的好抗体却可能是“汝之蜜糖，彼之砒霜”，广泛筛选最适抗体是提升国产试剂质量和性能的关键一环。
在我国体外诊断行业快速发展的过程中，我们已经取得了巨大的成就，但与国际巨头之间仍有不小的差距。对于我国抗体生产厂商而言，需要更加系统且严谨地认识抗体的质量控制，从原材料到最后的生产纯化都必须严格把关，为中国体外诊断试剂厂商做好坚实后盾，共同推动我国体外诊断行业走上更加健康的发展道路。
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