体外诊断产品相关原材料（二） -1
抗原（antigen，缩写Ag）指能够刺激机体产生（特异性）免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体外结合，发生免疫效应（特异性反应）的物质。抗原分子表面的有限部位能与抗体分子结合，称此部位为抗原决定簇（antigen determinant）或表位（epitope）。因此抗原的抗原性主要决定于抗原分子的化学性质。如抗原为蛋白质分子，其抗原性可决定于其氨基酸序列或其空间构型。
抗原分子的B细胞决定簇大小不同，其最大表面积约为50～70mm约由4～6氨基酸残基或糖基组成。100个氨基酸残基多肽可有14到20个非重叠决定簇，由线状排列彼此相邻的氨基酸组成，故称为线性或连续性决定簇。而球蛋白是有三维空间的折叠肽链，故其大多数决定簇被掩盖在内部，可称为隐蔽性决定簇。只存在于其表面的决定簇可被免疫细胞识别，或与抗体结合者称为功能性决定簇（图）。组成这种决定簇的氨基酸，是由折叠的肽链将有同位置的氨基酸使之相邻成为有一定空间构型的决定簇，故称为构像决定簇或不连续决定簇。现已证明抗原分子的抗原性是由其组成的氨基酸予列、空间构型及其决定簇片段的移动决定的。
许多天然物质可诱导免疫应答，其中大分子蛋白质和多糖具有强免疫原性，小分子多肽及核酸也具有免疫原性。
1化学组成
大分子蛋白质，分子量大于10000者，可含有大量不同的抗原决定簇，是最强的免疫原。如异种血清蛋白、酶蛋白及细菌毒等，是强免疫原蛋白质的例子。
多糖是重要的天然抗原，纯化多糖或糖蛋白、脂蛋白以及糖脂蛋白等复合物中的糖分子部分都具有免疫原性。在自然界，许多微生物有富含多糖的荚膜或胞壁，细菌内毒素是脂多糖，以及一些血型抗原（A、B、C、H）也是多糖。
核酸分子多无免疫原性，但如与蛋白质结合形成为核蛋白则有免疫原性。在自身免疫病中，可见对天然核蛋白诱导的免疫应答产生的抗DNA或RNA抗体。
此外，多肽类激素如胰岛素虽为小分子量（6000）亦具有免疫原性。来自一种动物的胰岛素，如长期用于另一种动物，亦能诱导免疫应答产生抗体。
2分子量
凡具有免疫原性的物质，其分子量都较大，一般在1万以上，小于1万者呈弱免疫原性，低于4000者一般不具有免疫原性。许多小的免疫性原性分子可激发细胞免疫，而不产生抗体。亦有大分子量物质，如明胶分子量可达10万，但因其为直链氨基酸结构，易在体内降解为低分子物质，所以呈弱免疫原性。可见免疫原性除与分子量有关外，还与其化学结构相关。
3化学结构
在蛋白质分子中，凡含有大量芳香族氨基酸，尤其是含有酷氨酸的蛋白质，其免疫原性强；而以非芳香族氨基酸为主的蛋白质，其免疫原性较弱。蛋白质和多糖抗原，凡结构复杂者免疫原性强，反之则较弱。其复杂性是由氨基酸和单糖的类型及数量等决定的。如聚合体蛋白质分子较单体可溶性蛋白质分子的免疫原性强。
自发现抗体后，用血清学方法在体外实验，证明了天然抗原与其相应抗体发生特异性结合，这是一个重要的免疫学现象，称这种特性为抗原的抗原性。在早期由于尚未建立对蛋白质抗原进行分析的方法，为研究抗原性的化学本质造成了困难。奥地利免疫化学家Landsteiner在本世纪20年代创建了人工结合抗原，并应用血清学方法对抗原性的化学本质进行了系统的研究，为抗原、抗体的相互作用提供了大量知识，为天然抗原化学性质的研究奠定了基础。
抗原在诊断工业的用途，一方面是与前文抗体的用途相对，用来检测抗体如自身抗体、传染性疾病抗体等，另一方面广泛地应用于试剂盒的标准品、质控品和校准品的制备，对血液样本中的待测抗原进行定量。
抗原产品主要分为天然抗原、重组抗原、合成抗原等。天然抗原可取自动物组织、微生物培养物等，需经提取纯化才能使用；重组抗原是抗原基因在质粒体中表达的蛋白质抗原，多以大肠杆菌或酵母菌为质粒体。重组抗原的优点是除工程菌成分外，其他杂质少，而且无传染性，但纯化技术难度较大。重组抗原的另一特点是能用基因工程制备某些无法从天然材料中分离的抗原物质。合成多肽抗原是根据蛋白质抗原分子的某一抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。多肽抗原一般只含有一个抗原决定簇，纯度高，特异性也高，但由于分子质量太小，往往难以直接吸附于固相上。多肽抗原的包被一般需先使其与无关蛋白质如牛血清白蛋白等偶联，借助于偶联物与固相载体的吸附，间接的结合到固相载体表面。
抗原性能的核心是对其在待测样本中存在形式的真实模拟。在工业生产中，抗原作为免疫原也决定了由其产生的抗体的关键性能，如特异性和灵敏度。不同抗原的比较如下图。
抗原作为主要的核心原材料，对于整个免疫检测分析系统有着至关重要的影响。除去试剂制备工艺外，抗原自身的性能可在很大程度上决定着检测试剂的质量。目前，衡量抗原质量的技术指标没有统一标准，但是可以大概总结为生物活性、纯度、批间差、稳定性等。
抗原的生物活性首先要求该产品与临床样本中的天然抗原具有高度一致的免疫化学特性，除了具备相同的氨基酸残基数、相同的分子量，还需要有相同的空间构象和修饰。为获得优质的抗原，原料生产厂家往往需要先对样本中天然抗原的存在形式进行深入研究，如微生物致病株的特异性抗原表位、人体内天然蛋白在临床样本中的存在形式、在检测体系中存在的干扰因素等等，从而设计该抗原的研发和生产路径——进行天然提取或重组、合成；采用原核细胞或真核细胞表达；以游离形式或多聚体形式甚或带有载体；甚至产品以冻干粉、冻液或液体形式交付，都可能影响抗原的生物活性，需经过原料厂商严谨细致的反复验证。
关于纯度，与抗体一样，当抗原作为原料用于检测抗体时，往往需要先将抗原进行修饰，当抗原纯度不够时，会导至其他杂蛋白被一起偶联于固相介质或者标记物上，从而影响了试剂的反应性能，如特异性、反应信号、背景值等。抗原的纯度测定主要有SDS-PAGE电泳后的条带扫描和HPLC测试等。
重复性/批间差，是指每批次产品的可重复性。重复性则是保证体外诊断试剂降低批间差异并且稳定生产的前提条件。另外，如前所述，重复性和生产工艺密切挂钩，因此也是体现抗原质量的关键指标。
稳定性是指在特定的储存条件下，一定时间内抗原保持其活性的能力。抗原不像抗体那么稳定，为保持抗原的稳定性，多数供应商提供的抗原的储存条件为-20℃或-70℃，或4度储运的冻干粉，并强调抗原稀释分装后应冷冻保存。而抗原制备产品的稳定性由含各种保护成分如BSA、尿素、或商用蛋白稳定剂保驾护航，该类Buffer往往也成为诊断试剂公司秘而不宣的核心竞争力之一。
采购抗原制定质量标准时，一般重点包含以下几个方面：
性状：澄清均一的液体或溶解/复溶后为澄清均一的液体，不应含有异物、浑浊或摇不散的沉淀或颗粒。（部分抗原天然存在微白或浑浊现象，厂家一般有说明）
纯度与分子量：纯度标准按需设定，纯度越高价格越高；采用SDS-PAGE凝胶电泳确定纯度与分子量。
生物安全性：人源抗原务必要求原料供应商确保HBsAg、HCV、HIV、TP呈阴性。
效价和功能性实验：建议试剂厂商与原料供应商协商确定基准批次，对新批次的功能性实验以与基准批次的平行对照结果为依据进行验收。
1. 酶
2.1生化酶
酶是体外诊断工业的重要原料，是临床化学和分子诊断的核心原料，也是免疫诊断中酶-底物信号体系中不可或缺的成分。本小节主要介绍作为临床化学核心原料的生化酶和作为分子诊断核心原料的分子诊断酶、引物、探针及相关产品。
酶是生物催化剂，是由组织细胞合成的、具有生物催化功能的蛋白质（少数是核酸），对化学反应有强的催化性，对底物有极高的选择性（包括对底物的种类，底物的区域，位点和立体的选择性），一种酶只能够催化一种底物的一种反应，反应的转化率和产率很高，几乎没有副反应。酶的特性使得其在临床检验，化学分析和特定产品生产上优势远远超过其他化
学方法。人体内只有酶存在才能进行各项生化反应，所以人体内的新陈代谢和酶的催化息息相关。一般来说，健康人体内酶活性和酶量相对恒定，当人体某些器官和组织发生病变时，特定的酶被释放入血、尿或体液中，与之相关的酶量或者活性会发生相应的变化。例如，当胰腺发生急性病变时，脂肪酶大量释放入血，其血清表达水平和胰腺炎病情严重程度有一定的相关性，早期检测血清脂肪酶可以较好地区分急性和非急性胰腺炎。因而使用相应的工具酶检验试剂盒等诊断工具测定血、尿或体液内酶量或者活性变化，可以诊断某些疾病。
人类使用酶的历史源远流长。相传夏禹时期，我国人民就发明了酿酒，后来又开始用豆发酵做成酱油等，在公元前6世纪，我国已经开始用曲治疗肠胃病，这估计是人类最早将酶应用于疾病治疗。19世纪初，科学家们发现胃液可以消化肉块，植物提取物或者唾液可以将淀粉转化成糖，但是他们并不清楚具体是什么物质在起作用。法国化学家Louis Pasteur 在研究淀粉转化成糖，又经过酵母作用发酵成酒精的过程中，他提出这种发酵是由酵母中的一种活性物质催化的，他将这种物质称之为酵素（ferment）。现在日语中酶就是“酵素”二字，一些欧洲国家仍然沿用了酵素一词，立陶宛有一个做酶的公司名字就是Fermentas，后来被Thermofisher收购。1878年，德国生理学家Wilhelm Kühne第一次将这种物质称之为Enzyme，源于希腊语：ενζυμον，意为发酵中，用来描述这个催化过程。1926年，美国科学家J.B.Sumner从刀豆中提取出脲酶，并证实脲酶其实是一种蛋白质。20世纪30年代，科学家们相继提取出多种酶的蛋白质结晶，并指出酶是一类具有生物催化作用的蛋白质。后来科学家们又发现有一些RNA具有酶催化活性，称之为核酶。所以确切的说，绝大多数酶是蛋白质，有些酶是核酸和蛋白酶的复合体，少数酶是核酸。
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