人 NK T 细胞的分离和扩增

2019.4.07

实验步骤	基本方案 1 NK T 细胞的鉴定材料外周肝素抗凝血 P B S R P M I -1640 培养基，含 1 0 % (V /V ) 人血清或 F C S 以及 10U /m l I L -2 (可选）流式细胞缓冲液（flow cytometry buffer， FCbuffer) : 含 1 % (v/V ) 人血清、1 % (V / V ) FBS 和 0. 1 % (m /V ) 叠氮钠的 PBS 荧光素标记的抗 V a 24 单抗（cloneC15B 2 ， P E 或 FITC 标记， Coulter-Immunotech) 荧光素标记的抗 V p i l 单抗（clone C 21D 2, P E 或 F I T C 标记， Coulter) 突光素标记的同型对照抗体（BDPharmingen) 突光素标记的抗 6B 1 1 单抗（B D Pharmingen; 可选） Cy5 标记的抗 C D 4 单抗、 Cy5 标记的抗 C D 8 单抗（BDPhanningen，可选）荧光素标记的抗 C D 161 单抗（Coulter，推荐使用）荧光素标记的其他相关抗体（可选）含 4 % 甲醛的 PBS (P B S w ith 4 % paraformaldehyde， P F A ) : 配制时置通风橱中，加热至 80°C ，可搅拌以加速溶解，冷后分装，一 20°C 保存 0.5m l 微量离心管或 9 6 孔细胞培养板流式细胞仪 1 . 准备人外周肝素抗凝血（5〜10 ml) ，根据情况，室温可保存 I d 。 Ficoll-Hypaque 密基本方案 2 免疫磁珠法分离 NK T 细胞及后续扩增本法可从几毫升的外周血中分离和扩增 N K T 细胞（< 1 0 000 N K T 细胞），浓缩白细胞（分离血小板时的副产品）也可作为 N K T 细胞的来源。材料（带 V 项目见附录 1) 外周肝素抗凝血 P B S ，含 2m m o l / L E D T A (附录 1) 未标记的抗 V 〇 t 2 4 单抗（Coulter) 未标记的抗 6B 1 1 单抗，即抗 TCRot 单抗（B D Pharmingen) 备选方案 I N K T 细胞的流式分选及扩增附加材料备选方案 2 NK T 细胞的克隆附加材料（其他材料见基本方案 1 和 2) 1 T 细胞克隆培养基： R P M I -1640，含 1 0 % (W V ) 自体人血清、 20U /m l I L -2 及20U/ml IL-7植物血凝素 (phytohemagglutinin-P ， P H A -P ; Difco) 1.Ficoll-Hypaque 密度梯度离心法分离 T O M C (单元 8.1)。取出部分细胞，照射灭活后用作饲养细胞。 2 . 剩余细胞用 P B S 洗涤一遍，加入含 1 0 % 人血清的 P B S 重悬细胞，调整浓度为 IO⁸个细胞/m l ，冰浴 15 min。 3 . 加入荧光素标记的抗 V a 2 4 单抗和另一种荧光素标记的抗 V p i l 单抗（或标记的抗6B 11 单抗，推荐使用），终浓度均为 IOiU g A n U 冰浴 30 min。同时，取部分细胞加入相应的同型对照抗体。 4 . 在 9 6 孔圆底培养板中加入 IO5 照射灭活后（5000rad) 的自体饲养细胞和 P H A - P(终浓度 2ug/ml) ，补充 T 细胞克隆培养基至终体积 0.1m l 。同时用流式分选仪分选V a24+ Vpll+ (或 6B 1 1 + ) 双阳性细胞，分选出的细胞应直接加入上述 9 6 孔板中。 5.—周后，每孔加入 0.1 ml T 细胞克隆培养基（不含 P H A -P )。显微镜下观察细胞生长情况： 10〜M d 后，阳性孔中会出现一个或多个母细胞克隆（母细胞圆形，体积较大，每个克隆细胞数超过 100 个）。 6 . 根据克隆生长情况，每隔 2〜3d 用 T 细胞克隆培养基传代。如果用自体血清进行 T克隆，当细胞扩增后，每次传代时培养基中增加 2 5 % 的异体人血清或 F B S ，直至完全取代自体血清。 7 . 当细胞数量足够时，用流式细胞仪检测不同克隆的 V a 2 4 和 Vpll ( 或 6B 1 1 ) 表达情况。 3 〜4 周后，细胞可进行二次刺激，或者在 T 细胞克隆培养基中继续培养几周。辅助方案 NK T 细胞的二次刺激和克隆材料 4.第 1 天，加入重组 IL-2 及 IL-7 各 50U /m l 。 5 . 第 5 天，用新鲜培养基进行半量换液，维持各细胞因子浓度为 50U /m l 。 6 . 第 1 0 天，在显微镜下观察 T 细胞克隆扩增情况。如果母细胞密度较高且培养基颜色变黄，用含细胞因子的扩增培养基将细胞进行 1 : 2 传代。对于生长旺盛的细胞，可每隔 2〜3d 进行细胞传代。经过 2 周左右时间细胞可扩增约 1000 倍。在无追加刺激的情况下，细胞可继续培养几周。展开

实验步骤

基本方案 1 NK T 细胞的鉴定

材料

外周肝素抗凝血

P B S

R P M I -1640 培养基，含 1 0 % (V /V ) 人血清或 F C S 以及 10U /m l I L -2 (可选）

流式细胞缓冲液（flow cytometry buffer， FCbuffer) : 含 1 % (v/V ) 人血清、1 % (V / V ) FBS 和 0. 1 % (m /V ) 叠氮钠的 PBS

荧光素标记的抗 V a 24 单抗（cloneC15B 2 ， P E 或 FITC 标记， Coulter-Immunotech)

荧光素标记的抗 V p i l 单抗（clone C 21D 2, P E 或 F I T C 标记， Coulter)

突光素标记的同型对照抗体（BDPharmingen)

突光素标记的抗 6B 1 1 单抗（B D Pharmingen; 可选）

Cy5 标记的抗 C D 4 单抗、 Cy5 标记的抗 C D 8 单抗
（BDPhanningen，可选）

荧光素标记的抗 C D 161 单抗（Coulter，推荐使用）

荧光素标记的其他相关抗体（可选）

含 4 % 甲醛的 PBS (P B S w ith 4 % paraformaldehyde， P F A ) : 配制时置通风橱中，加热至 80°C ，可搅拌以加速溶解，冷后分装，一 20°C 保存

0.5m l 微量离心管或 9 6 孔细胞培养板

流式细胞仪

1 . 准备人外周肝素抗凝血（5〜10 ml) ，根据情况，室温可保存 I d 。 Ficoll-Hypaque 密

基本方案 2 免疫磁珠法分离 NK T 细胞及后续扩增

本法可从几毫升的外周血中分离和扩增 N K T 细胞（< 1 0 000 N K T 细胞），浓缩白细胞（分离血小板时的副产品）也可作为 N K T 细胞的来源。

材料（带 V 项目见附录 1)

外周肝素抗凝血

P B S ，含 2m m o l / L E D T A (附录 1)

未标记的抗 V 〇 t 2 4 单抗（Coulter)

未标记的抗 6B 1 1 单抗，即抗 TCRot 单抗（B D Pharmingen)

备选方案 I N K T 细胞的流式分选及扩增

附加材料

备选方案 2 NK T 细胞的克隆

附加材料（其他材料见基本方案 1 和 2) 1

T 细胞克隆培养基： R P M I -1640，含 1 0 % (W V ) 自体人血清、 20U /m l I L -2 及20U/ml IL-7植物血凝素 (phytohemagglutinin-P ， P H A -P ; Difco)

1.Ficoll-Hypaque 密度梯度离心法分离 T O M C (单元 8.1)。取出部分细胞，照射灭活后用作饲养细胞。

2 . 剩余细胞用 P B S 洗涤一遍，加入含 1 0 % 人血清的 P B S 重悬细胞，调整浓度为 IO⁸个细胞/m l ，冰浴 15 min。

3 . 加入荧光素标记的抗 V a 2 4 单抗和另一种荧光素标记的抗 V p i l 单抗（或标记的抗6B 11 单抗，推荐使用），终浓度均为 IOiU g A n U 冰浴 30 min。同时，取部分细胞加入相应的同型对照抗体。

4 . 在 9 6 孔圆底培养板中加入 IO5 照射灭活后（5000rad) 的自体饲养细胞和 P H A - P(终浓度 2ug/ml) ，补充 T 细胞克隆培养基至终体积 0.1m l 。同时用流式分选仪分选V a24+ Vpll+ (或 6B 1 1 + ) 双阳性细胞，分选出的细胞应直接加入上述 9 6 孔板中。

5.—周后，每孔加入 0.1 ml T 细胞克隆培养基（不含 P H A -P )。显微镜下观察细胞生长情况： 10〜M d 后，阳性孔中会出现一个或多个母细胞克隆（母细胞圆形，体积较大，每个克隆细胞数超过 100 个）。

6 . 根据克隆生长情况，每隔 2〜3d 用 T 细胞克隆培养基传代。如果用自体血清进行 T克隆，当细胞扩增后，每次传代时培养基中增加 2 5 % 的异体人血清或 F B S ，直至完全取代自体血清。

7 . 当细胞数量足够时，用流式细胞仪检测不同克隆的 V a 2 4 和 Vpll ( 或 6B 1 1 ) 表达情况。

3 〜4 周后，细胞可进行二次刺激，或者在 T 细胞克隆培养基中继续培养几周。