蛋白质的盐析分级分离及凝胶层析脱盐实验
蛋白质盐析
| 实验方法原理 |
用大量中性盐使蛋白质从溶液中析出的过程称为蛋白质的盐析作用。蛋白质是亲水胶体,
在高浓度的中性盐影响下脱去水化层, 同时, 蛋白质分子所带的电荷被中和,
结果蛋白质的胶体稳定性遭到破坏而沉淀析出。经透析或用水稀释时又可溶解,
故蛋白质的盐析作用是可逆过程。盐析不同的蛋白质所需中性盐浓度与蛋白质种类及pH 有关。分子量大的蛋白质(如球蛋白) 比分子量小的( 如白蛋白)
易于析出。改变盐浓度, 使不同分子量的蛋白质分别析出。
含盐蛋白质溶液流经凝胶层析柱时, 小分子量的盐分子因进入凝胶颗粒的微孔中, 所以向下移动的速度较慢; 而大分子的蛋白质不能进入凝胶颗粒的微孔, 以较快的速度流过凝胶柱, 从而使蛋白质与盐分开。
蛋白质分子中具有芳香族氨基酸残基, 因此, 对280 nm 的紫外光有最大吸收, 且成正比, 符合Beer 定律。将分步收集的样品液于紫外分光光度计检测, 收集蛋白质样品。 |
|---|---|
| 实验材料 | 蛋清 血清 |
| 试剂、试剂盒 | 饱和硫酸铵溶液 硫酸铵 葡聚糖凝胶SephadexG-25 |
| 仪器、耗材 | 试管 三角漏斗 玻棒 滤纸 试管架 752 型紫外分光光度计 石英比色皿 玻璃层析柱 乳胶管 止水夹 |
| 实验步骤 |
1. 卵清蛋白的分离
(1)取卵清约2 ml 于试管中, 加等体积的饱和硫酸铵溶液,搅拌均匀, 蛋白质析出, 静置, 用滤纸过滤致滤液澄清, 沉淀即为卵球蛋白, 将此沉淀用2 ml 半饱和硫酸铵洗涤一次。
(1)凝胶柱的准备: 称取葡聚糖凝胶sephadexG-25 5 g , 加入80 ml 洗脱液(蒸馏水) , 在沸水浴中溶涨30 min , 用倾泻法倾去悬浮的小颗粒。然后装进内径1 . 2 cm, 高30 cm 的玻璃层析柱内。注意装填均匀, 无气泡和裂纹存在, 并保持液面在凝胶床表面以上。 (4)画出蛋白质280 nm 吸收曲线图, 将蛋白质溶液收集待用。
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| 注意事项 |
1. 上述操作中加入固体硫酸铵的量可参看附录计算后加入。
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