凝胶层析法(凝胶过滤)脱盐和分离蛋白质-2
（3）在开始收集洗脱液的同时检查蛋白质是否已开始流出。为此，由每支收集管中取出1滴溶液置于黑色比色磁盘中，加入1滴20%磺基水杨酸，若呈现白色絮状沉淀即证明已有蛋白质出现，直到检查不出白色沉淀时，停止收集洗脱液。
（4）由经检查含有蛋白质的每管中，取1滴溶液，放置在白色比色盘孔中，加入1滴奈氏试剂，若呈现棕黄色沉淀说明它含有硫酸铵。合并检查后不含硫酸铵的各管收集液，即为“脱盐”后的IgG。
注意：在检测时，用皮头滴管吸取管中溶液后应及时洗净，再吸取下一管，以免造成相互污染假象。
试剂和器材
（1）Sephadex G-25。
（2）0.0175mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲液。
（3）奈氏（Nessler）试剂：于500ml锥形瓶内加入碘化钾150g，碘110g，汞150g及蒸馏水100ml。用力振荡7～15min，至碘的棕色开始转变时，混合液温度升高，将此瓶浸于冷水内继续振荡，直到棕色的碘转变为带绿色的碘化钾汞液为止。将上清液倾入2000ml量筒内，加蒸馏水至2000ml，混匀备用。
（4）20%（W/V）磺基水杨酸溶液。
（5）1.5cm×20cm层析柱。
（6）黑、白比色磁盘。
附：凝胶处理的基本操作
（1）凝胶溶胀（水化）商品葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶均为干燥颗粒。使用前必须水化溶胀。商品琼脂糖凝胶呈悬浮胶体可直接用，玻璃球不用溶胀。
凝胶溶胀有两种方法：一种是将所需葡聚糖凝胶浸入蒸馏水中于室温下溶胀；另一种是置于 水浴中溶胀。各种葡聚糖在上述溶胀方法中所需的时间见下表：
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型号溶胀时间（小时）20~25℃ 分离范围（蛋白质，Mr） |
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G-103 至700 G-153 至1500 G-253 1000~1500 G-503 1500~3000 G-7524 3000~7000 |
必须浸泡足够的时间以使凝胶充分溶胀。两种方法中，沸 水浴溶胀不但节省时间，还可以杀灭凝胶中污染的细菌并排出网眼中气体。
凝胶溶胀后，需用蒸馏水洗涤几次，每次应将沉降缓慢的细小颗粒随水倾倒出去，以免在装柱后产生阻塞现象，降低流速。洗后将凝胶浸泡在洗脱液中待用。
一支层析柱中应该装入的干胶量可以用下法推算：称取1g所需型号的葡聚糖干胶，放在5ml量筒中，用室温溶胀的方法充分溶胀，观察溶胀后凝胶的体积。然后在层析柱中加水到所需柱床高度，将水倒出，量取柱床体积。根据1g干胶溶胀后的体积和所需柱床体积，即可推算出干胶的需要量。
（2）装柱将层析剂装入柱中进行层析的方法称柱层析法。作层析用的柱子称层析柱。层析柱有玻璃和透明塑料的两种。柱子的一端为进口，另一端为出口，出口端底部有烧结玻璃砂板或尼龙布，能阻止层析剂流出，溶剂则可流过。如果没有市售的层析柱，可以选用粗细均匀，长短合适的玻璃管，在两端塞上合适的胶塞，胶塞中插人细玻璃管，在一端放一层尼龙布为出口，即可作为层析柱使用。层析柱的长短粗细根据实验的目的而定，一般说来，凝胶层析时柱越长，分离效果越好。但柱过长，层析时间长，样品易稀释造成扩散，反而影响分离效果。柱的内径不宜较细，直径1cm以下的柱易发生“管壁效应”，即柱中部分的物质组分移动较快，管壁周围的则移动较慢，造成分离混乱。当然柱的内径也不宜过粗。
凝胶层析中，在把小分子物质（mw<1 500），如无机或其他物质与大分子物质（mw<20
000）分离时，层析柱的体积一般约为样品的4–10倍，高度与直径的比例为5：1至15：1之间。这类柱也称为“脱盐”柱，常用网孔很小的凝胶如G–25。用以将生物大分子物质彼此分开的分级层析柱，体积应为样品体积的25～100倍。柱长度与直径的比例为20：1～100：1。
装柱的操作过程如下：将层析柱垂直固定在支架上，打开柱下口开关。将溶胀好的凝胶放在烧杯中，使凝胶表面上的水层与凝胶体积相等。用玻璃棒搅匀凝胶液，顺玻璃棒灌入柱内。此时柱下口一边排水，上口一边加入搅匀的凝胶，可见凝胶连续均匀地沉降，逐步形成凝胶柱。当到达所需凝胶柱高度时，立即关闭下口，待凝胶自然沉降形成凝胶柱床。凝胶柱床一般应离柱顶3~5cm，并覆盖一层溶液。
