土壤微生物的分离、纯化及初步鉴定
实验概要
分离、纯化及初步鉴定土壤中的拮抗植物病原菌的放线菌。
实验原理
土壤是微生物的“天然培养基”，也是最丰富的菌种资源库，我们可以从中分离出众多放线菌，尤其是可以从耕作土壤中筛选出拮抗植物病原菌的放线菌。
以耕作有武运粳和苏沪香粳的土壤为样品，应用稀释涂布平板法分离各种微生物。菌落计数后，通过菌落形态观察并挑取放线菌进行划线分离纯化，多次重复后得到单菌落。在进行放线菌形态等初步鉴定后，将纯化的菌株接入斜面传代保藏。最后，分离纯化的放线菌，初步鉴定其拮抗性。
拮抗植物病原菌的放线菌的分离纯化在农业增产、作物种植等方面都有着重要的意义。
主要试剂
1. 培养基：
高氏1号培养基、马铃薯葡萄糖培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、葡萄糖蛋白胨水培养基
2. 其他试剂：
银染液A液 B液（细菌鞭毛染色） 40%KOH 5%α-萘酚（V.P.实验）
主要设备
培养皿
试管
锥型瓶
接种环
移液管
震荡器
电炉
载玻片
超净工作台
恒温培养箱
高压蒸汽灭菌锅
显微镜等
实验材料
土样：
苏沪香粳1，2组
杨稻6号 93113，4组
武运粳5，6组
实验步骤
1. 稀释涂布平板法(Spread Plate Method)
稀释涂布平板法是一种将菌体按比例制备成若干个稀释度，再分别经涂棒涂布培养而进行微生物分离纯化的方法。
(1) 倒平板；
(2) 制备土壤稀释溶液 连续不断稀释，得到不同稀释度的土壤溶液；
(3) 涂布 分别吸取三种稀释度菌液，均匀涂于培养基表面；
(4) 培养；
(5) 划线分离，直到获得纯培养。
2. 平板菌落计数法
平板菌落计数法是根据微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的现象进行的，也就是说一个菌落即代表一个单细胞。计数时，先将待测样品作一系列稀释，再取一定量的稀释菌液接种到培养皿中，使其均匀分布于平皿中的培养基内，经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，即可换算出样品中的含菌数。
这种计数法的优点是能测出样品中的活菌数。此法常用于某些成品检定（如杀虫菌剂），生物制品检定以及食品、水源的污染程度的检定等。但平板菌落计数法的手续较繁，而且测定值常受各种因素的影响。
对每个平板上的菌落计数，计算每克或每毫升土壤样品中含有细菌、放线菌的数量。公式如下：
菌体数量cfu/g（mL）土样== 同一稀释度重复的菌落平均数×稀释倍数
3. 平板划线分离法（Streak Plate Method）
平板划线分离培养法对混有多种菌的平皿，用接种环以无菌操作沾取少许待分离的材料,在无板表面进行平行划线和培养，使原来混杂在一起的菌种沿划线在琼脂平板表面分离，得到分散的单个菌落，以获得纯种。
(1) 倒平板；
(2) 划线 在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取上述的土壤悬液一环在平板上划线，从而将样品在平板上进行稀释，形成单个菌落；
(3) 挑菌落 同稀释涂布平板法，一直到分离的微生物认为纯化为止。
4. 插片显微观察法（放线菌）
插片培养法是实验室观察放线菌形态的一种基本方法，其步骤是：挑取青铜小单孢菌（Micromonospora chalcea）的少量孢子丝，将菌丝块接种于高氏一号培养基的中间，然后，用小镊子夹起一块无菌的盖玻片，以45度角的角度斜插入培养基中，不要插入培养基太深，让菌丝爬上盖玻片；于37℃下培养3～5天后，再用小镊子将盖玻片取出，显微镜下观察基内菌丝、气生菌丝和孢子丝的形状。
5. 斜面传代保藏法
斜面传代保藏法是指将菌种（细菌和酵母菌宜采用对数生长期细胞，放线菌和丝状真菌宜采用成熟的孢子）接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生长后，棉塞部分用油纸包扎好，移至2-8℃的冰箱中保藏。
保藏时间依微生物的种类而有不同，霉菌、放线菌及有芽孢的细菌保存2-4个月，移种1次。酵母菌2个月，移种1次。细菌最好每月移种1次。
此法为实验室和工厂菌种室常用的保藏法，优点是操作简单，使用方便，不需特殊设备，能随时检查所保藏的菌株是否死亡、变异与污染杂菌等。缺点是容易变异，因为培养基的物理、化学特性不是严格恒定的，屡次传代会使微生物的代谢改变，而影响微生物的性状；污染杂菌的机会亦较多。
6. 放线菌形态观察
(1) 放线菌菌落观察
放线菌的菌落质地致密，表面呈紧密的绒状，或坚实、干燥而多皱。由于基内菌丝长在培养基内，所以菌落与培养基结合较紧，不容易被挑起，或者被挑起后不容易破碎。当孢子丝形成大量孢子布满菌落表面时，使菌落呈絮状、粉末状或颗粒状，而与细菌菌落判然有别。此外，如用放大镜仔细观察，可以看见菌落周围有放射状菌丝。
(2) 放线菌主要通过形成无性孢子的方式进行繁殖。其孢子丝成熟时，分化形成许多孢子，称为分生孢子。分生孢子常具色素，呈白、灰、黄、橙黄、红、蓝、绿等颜色。
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