AAT最亮的钙离子荧光探针Calbryte的多种运用
Calbryte 系列染料与常见的Fluo-3和Fluo-4染料相比具有几个关键优势 。Calbryte 系列染料能产生更亮的信号，具有更优秀的信噪比，并大大增强了细胞保留能力。这些特点使Calbryte 系列染料成为传统的钙指示剂的绝佳替代品。
图1.在Fluo-4，AM（左）和Calbryte 520AM（右）的CHO-K1细胞中测量ATP反应。将CHO-K1细胞以50,000个细胞/ 100 µL /孔在黑色96孔板中接种过夜。加入含丙磺舒的HH缓冲液中的100 µL 10 µg / ml Calbryte 520 AM或含丙磺舒的HH缓冲液中的10 µg / ml Fluo-4，AM，并在37°C下孵育45分钟。然后除去染料加载溶液，并用200 µL HH Buffer /孔替换。加入ATP（50 µL /孔）以达到最终指示的10 µM浓度，然后用显微镜FITC通道（Keyence）成像。
Calbryte系列产品的命名
Calbryte 系列的染料是根据其最大发射波长命名的。例如，Calbryte 520在可见光谱的绿色区域发出荧光，而Calbryte 590和Calbryte 630在红色和深红色区域发出荧光。它们共有AM酯形式、盐形式（以钾盐形式）。AM酯形式是可渗透细胞的形式，可用于检测活细胞中的钙离子。盐形式主要用于校准钙指示剂。根据荧光信号强度计算细胞内钙浓度时，通常需要执行此步骤。盐形式的Calbryte 也可以用于向活细胞和组织中进行显微注射。
Calbryte系列产品在活细胞中的作用机制
当测定活细胞中的钙离子时，合成具有几个乙酰氧基甲基酯（AM酯）官能团的Calbryte 染料。这样做的原因有两个。首先，AM酯是亲脂性基团，当连接到Calbryte 核心结构时，会形成整体上更疏水的化合物。这种增加的疏水性使Calbryte AM酯易于渗透完整的脂质膜并渗透到活细胞中。这消除了对电穿孔、显微注射或其他类似破坏性加载技术的需求；其次，Calbryte 染料虽然呈AM酯形式，但基本上是非荧光性且不可活化的。它们对存在于细胞外溶液中的微量Ca2+表现出最小的响应。只有当Calbryte 探针渗透到细胞中，并且只有在细胞内酯酶切割掉AM酯官能团之后，Calbryte 染料才被激活并对钙离子有反应。这两步激活过程非常重要，因为它极大地减少了非特异性背景荧光。并且通过扩展，它明显增强了细胞内钙离子信号；最后，一旦激活了Calbryte 探针，它就会通过典型的螯合过程检测细胞中钙的钙离子。但是，与其他螯合剂（例如Fluo-3和Fluo-4）不同，Calbryte 染料在与钙结合时会表现出更大的响应。在实验中，Calbryte 探针在螯合后会表现出大于300倍的荧光增加。相比之下，Fluo-4仅表现出100倍的增长。荧光响应的这种明显改善，使这种新型钙离子检测探针Calbryte对钙的检测极为稳定，这是过去的钙指示剂无法实现的。
Calbryte系列产品的优势
在活细胞实验中，Calbryte 染料的信噪比比其他染料（例如Fluo-4）大一个数量级，在实验研究中，这是一个巨大的优势，因为较差的信噪比对数据分析来说是非常头疼的问题。它将结果与其他信号混在一起，可能会遗失掉许多重要数据，并导致巨大的测定差异。因此，在选择试剂时，大多数研究人员更喜欢信噪比高的试剂。
信噪比不佳可能是由多种因素造成的，这些因素主要分为两类。第一类，存在导致信号强度差的因素。这些可以包括：
低消光系数和量子产率
与目标结合不佳
远离激发光源的最大吸光度（λmax）
Catbryte 系列染料的开发，完美的解决了以上问题。例如，Calbryte 520的量子产率是Fluo-3和Fluo-4的三倍。这意味着Calbryte 520吸收的每个光子从根本上比Fluo-3或Fluo-4发出更多的荧光，从而产生更亮的荧光信号。此外，所有Calbryte 系列染料的设计均应使其最大吸收率发生在标准激发源附近。例如，Calbryte 520（λmax = 492 nm）被常见的488 nm氩离子激发光线激发。
许多探针表现出较差的信噪比的第二个原因是由于高背景。高背景可能是由于以下原因造成的：
细胞不渗透
高自发荧光
非特异性激活/结合
细胞内保留性差
这些因素中的许多与探针进入细胞并有效定位于细胞质的能力有关。纵观过去的许多钙指示剂，它们经常遇到两个问题：1.探针要么是相当水溶性的，但太亲水而不能渗透活细胞，要么是疏水性足够渗透活细胞，但水溶性太差，在加载过程中会从溶液中沉淀出来，这两种情况都不可取。Calbryte 系列荧光染料通过控制水溶性官能团和前面提到的AM酯基来解决这个问题，通过优化，Calbryte 染料能够获得更高的信噪比。
图3.CHO-K细胞中内源性P2Y受体对ATP的反应。将CHO-K细胞以每100 µL 40,000个细胞的孔接种在黑色96孔板中过夜。将含有2 mM丙磺舒的HHBS中的100 µL Calbryte 520 AM（左），Calbryte 590 AM（中）或Calbryte 630 AM（右）加入孔中，并将细胞在37°C下孵育1小时。将染料加载介质替换为200 µL HHBS，用50 µL 50 µM ATP处理，并使用FITC通道（Calbryte 520），TRITC通道（Calbryte 590）或Texas Red通道Calbryte 630），用荧光显微镜成像（Keyence）。
