Mol Cell | 史俊炜课题组找到白血病治疗新靶点
急性髓系白血病（Acute Myeloid Leukemia, AML）是成年人中最为常见的急性白血病，其特征为造血前体细胞的增殖异常和分化能力减弱，造成大量未成熟的白细胞在骨髓、外周血，甚至其他组织聚集，而其他正常血细胞的数量急剧减少。大量的研究表明，AML由一系列在髓系前体细胞的基因突变最终造成。这些突变位点很多是重要的调控髓系细胞的转录因子（如RUNX1, CEBPA）和表观因子（如DNMT3A, TET2, MLL, IDH1/2）【1】，且病人之间存在很强的异质性，根据突变类型的不同，可能需要采取完全不同的治疗手段。目前大部分的致癌（突变）敏感基因（oncogenic vulnerability）都难以使用小分子药物直接靶向，因此最近提出靶向非致癌敏感基因（non-oncogenic vulnerability）的策略。这类基因通常在癌细胞里没有突变，也不一定在癌细胞里有异常的表达，但是（某一类）癌细胞对这类基因的抑制高度敏感。在AML中，不少靶向这类基因的药物已进入临床实验，包括很多表观因子，如BRD4, DOT1L及LSD1【2】。目前对于不同亚型的白血病对转录因子和表观因子的研究仍然不够系统和全面，对于AML内是否还存在其他的非致癌敏感基因还有待更深入的研究。
2021年8月5日，宾夕法尼亚大学医学院史俊炜课题组（第一作者为实验室博士研究生曹镇东）于Molecular Cell上发表了题为 ZMYND8-regulated IRF8 transcription axis is an acute myeloid leukemia dependency 的研究论文，利用CRISPR-Cas9在大量癌症细胞系里对转录和表观因子进行了系统的研究，发现了一个AML特异的转录环路（transcriptional circuit），并鉴定了一个表观阅读因子ZMYND8可特异性地在白血病里维持该转录因子以及MYC通路，为治疗白血病提供了一条潜在的治疗策略。
研究人员首先分析了先前实验室所做的全基因组范围内的转录因子CRISPR筛选结果【3】，发现了一个新基因IRF8只在部分AML细胞里被高度依赖，而其他AML和实体瘤对IRF8敲除完全不敏感。在正常细胞中，IRF8特异地只在血液系统里表达，对髓系细胞的分化有着重要的决定作用【4】。在部分AML病人和细胞系里，IRF8异常上调，且和某一些基因突变高度正相关，比如MLL易位和扩增， CBFB-MYH11易位, RUNX1突变等，且不同病人之间具有高度异质性。随后研究人员利用dTAG系统【5】构建了一株可快速特异降解IRF8的AML细胞系，验证发现IRF8的降解对该细胞系的生长有很强的抑制作用。
研究人员随后对短时间dTAG处理后的细胞做了RNA-seq分析，同时对CRISPR敲除IRF8的AML细胞系也做了RNA-seq, 发现另一个未报道过的转录因子MEF2D有明显下调。ChIP-seq结果也表明IRF8结合在MEF2D启动子附近，可直接调控MEF2D的表达。MEF2D在先前的CRISPR筛选里和IRF8的表型非常类似，在不同细胞系的表达量也与IRF8类似。意外的是，对MEF2D敲除的细胞系做RNA-seq发现IRF8也显著下调，表明二者可能形成一个转录上的环路，推测这种环路类似于先前发现的在胚胎干细胞里发现的OCT4/NANOG/SOX2环路，对于基因的迅速扩增表达和维持细胞的identity有着重要的意义【6,7】。
由于药理学上靶向转录因子十分困难【8】，研究人员希望通过筛选表观因子，找到潜在的可调控IRF8-MEF2D环路的基因。为此，研究人员选取了三类细胞系做CRISPR筛选，包括1）IRF8高表达的AML, 2) IRF8低/不表达的白血病，和3）实体瘤细胞系（不表达IRF8），并找到了一个表观阅读因子ZMYND8, 和IRF8敲除后的表型高度相关，并在体外和小鼠体内均得到了验证。重要的是，在分离的小鼠体内的骨髓细胞中敲除ZMYND8, 并不影响体外骨髓细胞的正常分化。这些实验结果暗示靶向ZMYND8可作为一条特异、有效力，且毒副作用较小的治疗AML的途径。
利用类似研究上文IRF8的方法，研究人员构建了一株可快速降解ZMYND8的细胞系。dTAG处理后的RNA-seq结果表明，两个AML的重要转录因子MYC和IRF8是最明显下调的两个基因，随后的CRISPR-KO RNA-seq进一步证实了这个现象，并且发现ZMYND8只在白血病里调控MYC和IRF8 （如果IRF8有表达的情况下），而在没有表型的实体瘤里并不存在这条通路。在白血病内过表达MYC或IRF8，可部分回补因ZMYND8敲除所造成的白血病生长缓慢的表型，而如果同时表达MYC和IRF8可完全回补该表型（但是并不能回补pan-essential基因PCNA，或者白血病重要基因KMT2A, ZFP64, LSD1, DOT1L敲除造成的表型）。这些结果表明，ZMYND8维持白血病主要是依靠MYC和IRF8两条通路。有趣的是，先前在实体瘤的研究中发现，ZMYND8作为肿瘤抑制因子，可在基因的增强子处抑制基因的过度表达【9,10】。本篇研究则表明在血液病里，ZMYND8可能行使的是完全相反的功能。实际上，在不同肿瘤中行使相反功能的基因并不少见，而具体的原因还有待进一步阐明。
为了进一步研究ZMYND8的调控机制，研究人员做了ZMYND8的切和跑（CUT&RUN）实验，发现与先前的报道一致【9-11】，ZMYND8定位在H3K27ac/H3K14ac富集的染色质区域，并且和另一个重要的白血病基因BRD4高度重叠。进一步观察发现，ZMYND8确实结合在MYC的白血病特异的增强子【12】上。由于白血病里IRF8的增强子未有过明确报道，研究人员选取了IRF8上下游约100kb的非编码区域，通过CRISPRi, 4C-seq等技术手段，找到了一个重要的IRF8增强子区域，并在病人样品里也得到了印证。有趣的是，该增强子同源位点在今年发表的一篇Nature Immunology上，被报道特异性地调控髓系世代Irf8的表达，而删除这段区域会导致树突状细胞（dendritic cells）的缺失和Ly6C+单核细胞（monocytes）的过度生成【13】。这表明癌细胞可能会劫持正常细胞里对细胞的生长发育有着重要功能的增强子来维持其失调的转录网络【14】。
鉴于ZMYND8和BRD4定位的高度相关性，研究人员想进一步研究二者之间是否存在直接的功能上的关联。研究人员首先对ZMYND8快速降解细胞系加dTAG处理，发现BRD4对染色质的结合基本不受影响；而加BRD4的抑制剂JQ1后，ZMYND8对染色质结合极大地减弱，表明BRD4位于上游，可招募ZMYND8到染色质的增强子区域。免疫共沉淀的结果表明，BRD4的ET结构域可介导与ZMYND8的 PHD-BD-PWWP表观阅读串联结构域的互作，推测可能是ET结构域上的某个化学修饰被ZMYND8识别，至于具体是什么修饰还有待更深入的研究。
Bromodomain (BD) 和PWWP结构域近年来被广泛报道报道可作为小分子抑制剂的靶点【15-18】，而鉴于ZMYND8串联结构域和BRD4之间的联系，研究人员进一步探索了该结构域对于白血病生存的影响，在细胞系和小鼠体内的实验结果表明，ZMYND8的表观阅读结构域对于其在增强子处的结合、MYC和IRF8的表达，以及白血病的生长都是必需的。这些结果对将来设计靶向ZMYND8的抗癌药物有非常重要的意义。
综上所述，本研究报道了一条未被系统鉴定过的白血病特异通路，其上游是被髓系特异的转录因子招募的BRD4【19】，BRD4可进一步招募其他因子如ZMYND8。ZMYND8可调控MYC和IRF8的表达，而IRF8和MEF2D之间又可形成一条转录环路，可能对白血病的维持，以及对正常髓系细胞的分化都有重要作用。文章鉴定了一个重要的IRF8增强子，分析了IRF8 在癌细胞里的表达，这可能对于将来的临床诊断有着重要的指导意义。本研究对ZMYND8在血癌里的功能做了系统性的阐述，并提出其表观阅读结构域也具有结合非组蛋白的能力，对癌症生物学和染色质组学的研究都有重要的意义。ZMYND8作为一个高度可被小分子靶向的表观阅读因子，将来或许可以作为潜在的白血病治疗靶点。
宾夕法尼亚大学史俊炜课题组现致力于运用CRISPR技术手段，结合多种组学、单细胞测序等方法，寻找白血病和其他疾病模型中潜在的药物靶点，也致力于开发新型的CRISPR工具，并且与多个实验室有着密切的合作。其作为通讯或共同通讯作者已在Science, Cell, Nature Genetics, Cancer Cell, Nature Cell Biology, Molecular Cell, Nature Chemical Biology, Nature Communications等杂志上发表论文。目前实验室招聘博士后，有分子生物学、遗传学或生物信息学背景的人士优先。
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